Development of spinning disc, TIRF and confocal laser scanning microscopic centre for quick display of molecular processes and interactions in living cells (Q3958257)
Jump to navigation
Jump to search
Project Q3958257 in Hungary
| Language | Label | Description | Also known as |
|---|---|---|---|
| English | Development of spinning disc, TIRF and confocal laser scanning microscopic centre for quick display of molecular processes and interactions in living cells |
Project Q3958257 in Hungary |
Statements
173,062,170.0 forint
0 references
230,749,560.0 forint
0 references
75.0 percent
0 references
18 April 2017
0 references
30 November 2019
0 references
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM
0 references
47°29'30.62"N, 18°58'44.15"E
0 references
Az élő sejteken végzett megfigyelések kivitelezésére két egymást kiegészítő, fiziológiás körülmények közötti vizsgálatokat lehetővé tévő mikroszkópos rendszert szeretnénk beszerezni. A konfokális lézer pásztázó (CLSM) rendszer a fluoreszcens manipulációkra és mérésekre (fotoaktiválás, fotokonverzió, fotobleaching, Förster rezonáns energia transzfer [FRET]) nyújt kiváló lehetőségeket; a jelrögzítés specificitását a spektrális detektálás is megnöveli. Ennél a rendszernél a vizsgálatokat a látótéren belüli, tetszőlegesen kijelölt kisebb régiókra is fókuszálhatjuk. A spinning disc (SD) mikroszkópos rendszerrel az élő sejtekben zajló molekuláris folyamatokat a CLSM rendszerhez képest még gyorsabban, akár milliszekundomos képfelvételi sebességgel, a teljes látótérben tudjuk rögzíteni. Fontos szempont, hogy a felvételek készítésekor az élő sejteket kisebb fényterhelés éri, így a megfigyeléseket sokkal tovább tudjuk folytatni. A beszerezni kívánt SD rendszer alkalmas arra is, hogy a sejtfelszín közvetlen közelében (100-150 nm-es távolságon belül) zajló molekuláris folyamatokat a CLSM vizsgálatokhoz képest megnövelt felbontással és nagy sebességgel jelenítsük meg (TIRF, azaz teljes belső visszaverődéses mikroszkópia). Mindkét rendszer alkalmas arra, hogy két fluoreszcens jelet egyszerre, 2 detektorral (CLSM), illetve 2 kamerával (SD) tudjunk rögzíteni, így az élő sejtekben zajló molekuláris interakciókat, koncentrációváltozásokat és transzportfolyamatokat valós időben, specifikusan kövessük. A pályázatban résztvevő 14 kutatócsoport a gyulladásos és autoimmun betegségek hátterében álló, a tumorkialakulást és az áttétképződést, az idegrendszeri plaszticitás sejtszintű folyamatait, illetve a sejtek önemésztését befolyásoló molekuláris és sejtélettani hatásokat kutatja (ld. a csatolt életrajzokat). A célkitűzések széleskörűek, de közös jellemzőjük, hogy az élő sejtekben lezajló, dinamikus sejtbiológiai változások feltárására irányulnak. A beszerezni kívánt mikroszkópok a vizsgálatokhoz szükséges infrastrukturális feltételeket, a résztvevők kiemelkedő tudományos háttere pedig a kivitelezéshez szükséges tudásplatformot biztosítja. Az alábbiakban az alkalmazni kívánt mikroszkópos technikákat néhány főbb témán keresztül mutatjuk be. 1. A különböző immunsejtekben (pl. granulociták, makrofágok, dendritikus sejtek, limfociták) a receptorok ligandumkötését követő folyamatoknak, a receptorok között kialakuló „párbeszédnek” számos fiziológiás és kóros immunfolyamatban döntő szerepe van. Ilyen például a gyulladásban fontos granulociták komplementreceptorai és mintázatfelismerő receptorai közötti együttműködés is, amely a neutrofil extracelluláris csapdák (ún. NET-ek) képződéséhez vezet. A neutrofil sejtek aktivációját kísérő intracelluláris Ca2+ jel megváltozását fluoreszcens Ca-indikátor festékek (pl. Fluo3/Fluo4), a NET formálásra képes sejtvonalak esetében pedig genetikailag kódolt Ca2+ indikátorok (pl. GCaMP6) alkalmazásával mind a CLSM, mind a SD rendszeren vizsgálni tudjuk. A különböző immunsejtek letapadásának és kiterülésének, illetve a sejtfelszín közelében lejátszódó folyamatok (pl. NET kibocsátás) követésére a SD rendszerbe integrált TIRF mikroszkópia alapvető. A CLSM és SD rendszerek alkalmazásával, két fluoreszcens jel egyidejű detektálásával az immunsejtek működését szabályozó molekuláris hatásokat (pl. receptorok közötti interakció, a sejten belüli transzportfolyamatok) valós időben, a sejtfelszín közvetlen közelében és az aktiváció mérésével párhuzamosan tudjuk vizsgálni. 2. Az élőlények DNS-ében folyamatosan keletkező hibák javításának, a rákos átalakulás megelőzésének, illetve az új génváltozatok létrehozásának egyik leghatékonyabb módja a homológ rekombináció. Az in vitro megközelítés mellett teljes organizmusokban (fonalféregben és zebrahalban) vizsgáljuk, hogy a DNS-helikázok a sejtosztódás mely részfolyamataiban, milyen molekuláris aktivitások révén és mely fehérjepartnerekkel együtt segítik elő a rekombináció szabályozott lefutását, a pontos kromoszóma-szegregációt. A különböző fluoreszcens címkékkel jelölt, a hibajavító mechanizmusokban szerepet játszó fehérjéket termelő élő szervezetekben lezajló folyamatok detektálásában a két fluoreszcens jel egyidejű és gyors megjelenítést lehetővé tévő mikroszkópok alapvetőek. A CLSM és SD rendszerekkel készített elemzések ezért a már működő két-foton mikroszkópos rendszerrel elvégzett méréseket is kiegészítik. 3. Az elmúlt években a molekuláris tetoválás technológiájának kidolgozásával úttörő eredményeket értünk el az optofarmakológia területén. A fényaktiválható gyógyszerszármazékok kifejlesztésével lehetőségünk nyílik arra, hogy a CLSM rendszerben egyes sejtbiológiai folyamatokat mikrométeres területekre lokalizálva szabályozhassunk. Az idegsejtek aktin vázrendszerének dinamikus átalakulását (pl. az axonok növekedését és útkeresését) szabályozó folyamatokat nagy tér- és időbeli felbontással tudjuk feltárni. A miozinII axonnövekedést és az aktin dinamikát befolyá (Hungarian)
0 references
We would like to acquire two complementary microscopic systems to perform observations on living cells, allowing for physiological examinations. The confocal laser scanning (CLSM) system provides excellent opportunities for fluorescent manipulations and measurements (photoactivation, photoconversion, photobleaching, Förster resonant energy transfer (FRET)); the specificity of the signal recording is increased by spectral detection. In this system, we can focus the tests on the smaller regions within the field of vision, optionally designated. With the spinning disc (SD) microscopic system, we can record molecular processes in live cells even faster than the CLSM system, even at a millisecond image recording rate, in the entire field of vision. An important aspect is that living cells are subject to less light exposure during the recordings, so we can continue the observations much longer. The SD system to be procured is also suitable for displaying molecular processes in the immediate vicinity of the cell surface (within a distance of 100-150 nm) with increased resolution and high speed compared to CLSM tests (TIRF, i.e. full internal reflection microscopy). Both systems are capable of recording two fluorescent signals simultaneously with 2 detectors (CLSM) and 2 cameras (SDs), so that molecular interactions, concentration changes and transport processes in live cells are specifically tracked in real time. The 14 research teams participating in the tender are investigating the molecular and cell physiological effects of inflammatory and autoimmune diseases affecting tumour formation and metastasis, cellular processes of nervous plasticity and the self-digestion of cells (see attached biographies). The objectives are broad, but their common feature is that they aim to explore dynamic cell biological changes in living cells. The microscopes to be procured provide the necessary infrastructural conditions for the studies, and the outstanding scientific background of the participants provides the necessary knowledge platform for implementation. Below, the microscopic techniques to be used are presented through a few main themes. 1. In various immune cells (e.g. granulocytes, macrophages, dendritic cells, lymphocytes) processes following ligand binding of receptors, “dialogue” between receptors play a crucial role in many physiological and pathological immune processes. For example, cooperation between complement receptors and pattern recognition receptors for granulocytes important in inflammation, leading to the formation of neutrophil extracellular traps (so-called NETs). Changes in the intracellular Ca2+ signal accompanying neutrophil activation can be tested using fluorescent Ca-indicator inks (e.g. Fluo3/Fluo4) and genetically encoded Ca2+ indicators (e.g. GCaMP6) on both CLSM and SD systems for cell lines capable of forming NET. TIRF microscopy integrated in SD is essential to monitor the adhesion and spreading of various immune cells and processes near the cell surface (e.g. NET release). By using CLSM and SD systems, by detecting two fluorescent signals simultaneously, we can test the molecular effects that control the functioning of immune cells (e.g. interaction between receptors, intracellular transport processes) in real time, in close proximity to the cell surface and in parallel with the measurement of activation. 2. Homologous recombination is one of the most effective ways of correcting errors in the DNA of organisms, preventing cancer transformation and creating new gene variants. In addition to the in vitro approach, we test in whole organisms (worm and zebrafish) DNA-helicas in which sub-processes of cell division, through which molecular activities and with which protein partners they promote controlled recombination, accurate chromosomal segregation. Microscopes that allow simultaneous and rapid display of the two fluorescent signals are essential for detecting processes in organisms producing proteins that are involved in error correction mechanisms with different fluorescent labels. Analysis with CLSM and SD systems therefore complements the measurements carried out with the already existing two-photon microscopic system. 3. In recent years, by developing molecular tattoo technology, we have achieved groundbreaking results in the field of optofarmacology. With the development of light-activable pharmaceutical derivatives, we have the opportunity to regulate certain cell biological processes in the CLSM system by localising certain micrometres. The processes that control the dynamic transformation of the actin skeletons of nerve cells (e.g. growth and search for paths of axons) can be explored with high spatial and temporal resolution. MyosinII axon growth and actin dynamics flow (English)
9 February 2022
0.4480224536564121
0 references
Nous voudrions acquérir deux systèmes microscopiques complémentaires pour effectuer des observations sur des cellules vivantes, permettant des examens physiologiques. Le système de balayage laser confocal (CLSM) offre d’excellentes possibilités de manipulations et de mesures fluorescentes (photoactivation, photoconversion, photoblanchiment, transfert d’énergie par résonance Förster (FRET)); la spécificité de l’enregistrement du signal est augmentée par détection spectrale. Dans ce système, nous pouvons concentrer les tests sur les plus petites régions du champ de vision, éventuellement désignées. Avec le système microscopique à disque tournant (SD), nous pouvons enregistrer les processus moléculaires dans les cellules vivantes encore plus rapidement que le système CLSM, même à une vitesse d’enregistrement d’image milliseconde, dans tout le champ de vision. Un aspect important est que les cellules vivantes sont moins exposées à la lumière pendant les enregistrements, de sorte que nous pouvons continuer les observations beaucoup plus longtemps. Le système SD à acquérir est également adapté à l’affichage de processus moléculaires à proximité immédiate de la surface de la cellule (à une distance de 100-150 nm) avec une résolution et une vitesse accrues par rapport aux tests CLSM (TIRF, c’est-à-dire microscopie à réflexion interne complète). Les deux systèmes sont capables d’enregistrer deux signaux fluorescents simultanément avec 2 détecteurs (CLSM) et 2 caméras (SD), de sorte que les interactions moléculaires, les changements de concentration et les processus de transport dans les cellules vivantes sont suivis spécifiquement en temps réel. Les 14 équipes de recherche participant à l’appel d’offres étudient les effets physiologiques moléculaires et cellulaires des maladies inflammatoires et auto-immunes affectant la formation de tumeurs et les métastases, les processus cellulaires de plasticité nerveuse et l’autodigestion des cellules (voir les biographies ci-jointes). Les objectifs sont larges, mais leur caractéristique commune est qu’ils visent à explorer les changements biologiques cellulaires dynamiques dans les cellules vivantes. Les microscopes à acquérir fournissent les conditions d’infrastructure nécessaires pour les études, et l’expérience scientifique exceptionnelle des participants fournit la plate-forme de connaissances nécessaire à la mise en œuvre. Ci-dessous, les techniques microscopiques à utiliser sont présentées à travers quelques thèmes principaux. 1. Dans diverses cellules immunitaires (p. ex. granulocytes, macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes), les processus suivant la liaison du ligand des récepteurs, le «dialogue» entre les récepteurs jouent un rôle crucial dans de nombreux processus immunitaires physiologiques et pathologiques. Par exemple, la coopération entre les récepteurs de complément et les récepteurs de reconnaissance de patrons pour les granulocytes importants dans l’inflammation, conduisant à la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (appelés NET). Les changements dans le signal intracellulaire Ca2+ accompagnant l’activation des neutrophiles peuvent être testés à l’aide d’encres fluorescentes d’indicateurs Ca (par exemple Fluo3/Fluo4) et d’indicateurs de Ca2+ encodés génétiquement (par exemple GCaMP6) sur les systèmes CLSM et SD pour les lignées cellulaires capables de former NET. La microscopie TIRF intégrée à la DD est essentielle pour surveiller l’adhérence et la propagation de diverses cellules immunitaires et processus à proximité de la surface cellulaire (par exemple, la libération de NET). En utilisant des systèmes CLSM et SD, en détectant simultanément deux signaux fluorescents, nous pouvons tester les effets moléculaires qui contrôlent le fonctionnement des cellules immunitaires (par exemple, interaction entre les récepteurs, processus de transport intracellulaire) en temps réel, à proximité immédiate de la surface cellulaire et parallèlement à la mesure de l’activation. 2. La recombinaison homologue est l’un des moyens les plus efficaces de corriger les erreurs dans l’ADN des organismes, de prévenir la transformation du cancer et de créer de nouvelles variantes génétiques. En plus de l’approche in vitro, nous testons l’ADN-HELICAS d’organismes entiers (vers et poissons zèbres) dans lesquels les sous-processus de division cellulaire, à travers lesquels les activités moléculaires et avec quels partenaires protéiques ils favorisent la recombinaison contrôlée, une ségrégation chromosomique précise. Les microscopes qui permettent l’affichage simultané et rapide des deux signaux fluorescents sont essentiels pour détecter les processus dans les organismes produisant des protéines qui sont impliqués dans les mécanismes de correction des erreurs avec différentes étiquettes fluorescentes. L’analyse avec les systèmes CLSM et SD complète donc les mesures effectuées avec le système microscopique à deux photons déjà existant. 3. Ces dernières années, en ... (French)
10 February 2022
0 references
Željeli bismo steći dva komplementarna mikroskopska sustava za obavljanje promatranja živih stanica, omogućujući fiziološke preglede. Sustav konfokalnog laserskog skeniranja (CLSM) pruža izvrsne mogućnosti za fluorescentne manipulacije i mjerenja (fotoaktivacija, fotokonverzija, fotobijeljenje, Förster rezonantni prijenos energije (FRET)); specifičnost zapisivanja signala povećava se spektralnom detekcijom. U ovom sustavu možemo usredotočiti testove na manje regije unutar vidnog polja, po želji određene. Pomoću mikroskopskog sustava za predenje diska (SD) možemo snimati molekularne procese u živim stanicama čak i brže od CLSM sustava, čak i milisekundnom brzinom snimanja slike, u cijelom vidnom polju. Važan aspekt je da su žive stanice izložene manjoj izloženosti svjetlosti tijekom snimanja, tako da možemo nastaviti opažanja mnogo duže. SD sustav koji se nabavlja također je prikladan za prikazivanje molekularnih procesa u neposrednoj blizini površine stanice (unutar udaljenosti od 100 – 150 nm) s povećanom razlučivošću i velikom brzinom u usporedbi s CLSM testovima (TIRF, tj. potpuna unutarnja refleksija mikroskopija). Oba sustava mogu snimati dva fluorescentna signala istodobno s 2 detektora (CLSM) i 2 kamere (SD), tako da se molekularne interakcije, promjene koncentracije i transportni procesi u živim stanicama posebno prate u stvarnom vremenu. 14 istraživačkih timova koji sudjeluju u natječaju istražuju molekularne i stanične fiziološke učinke upalnih i autoimunih bolesti koje utječu na formiranje i metastaze tumora, stanične procese živčane plastičnosti i samoprobavljanje stanica (vidi priložene biografije). Ciljevi su široki, ali njihova zajednička značajka je da nastoje istražiti dinamičke stanične biološke promjene u živim stanicama. Mikroskopi koji se nabavljaju pružaju potrebne infrastrukturne uvjete za studije, a izvanredna znanstvena pozadina sudionika pruža potrebnu platformu znanja za provedbu. U nastavku su prikazane mikroskopske tehnike koje će se koristiti kroz nekoliko glavnih tema. 1. U različitim imunološkim stanicama (npr. granulociti, makrofagi, dendritičke stanice, limfociti) nakon vezanja liganda receptora, „dijalog” između receptora igra ključnu ulogu u mnogim fiziološkim i patološkim imunološkim procesima. Na primjer, suradnja između komplementarnih receptora i receptora za prepoznavanje uzoraka za granulocite važne za upalu, što dovodi do stvaranja izvanstaničnih zamki neutrofila (tzv. NET). Promjene unutarstaničnog signala Ca2+ koji prati aktivaciju neutrofila mogu se testirati pomoću fluorescentnih ka-indikatora (npr. Fluo3/Fluo4) i genetski kodiranih Ca2+ indikatora (npr. GCaMP6) na CLSM i SD sustavima za stanične linije koje mogu formirati NET. TIRF mikroskopija integrirana u SD je neophodna za praćenje adhezije i širenja različitih imunoloških stanica i procesa u blizini površine stanice (npr. oslobađanje NET-a). Korištenjem CLSM i SD sustava, otkrivanjem dva fluorescentna signala istovremeno, možemo testirati molekularne učinke koji kontroliraju funkcioniranje imunoloških stanica (npr. interakcija između receptora, unutarstanični transportni procesi) u stvarnom vremenu, u neposrednoj blizini stanične površine i paralelno s mjerenjem aktivacije. 2. Homologna rekombinacija jedan je od najučinkovitijih načina za ispravljanje pogrešaka u DNK organizama, sprječavanje transformacije raka i stvaranje novih varijanti gena. Osim in vitro pristupa, testiramo na cijelim organizmima (crvi i zebrastica) DNA-HELICAS u kojima podprocesi stanične diobe, kroz koje molekularne aktivnosti i s kojim proteinskim partnerima promiču kontroliranu rekombinaciju, točnu kromosomsku segregaciju. Mikroskopi koji omogućuju istodobno i brzo prikazivanje dvaju fluorescentnih signala ključni su za otkrivanje procesa u organizmima koji proizvode proteine koji su uključeni u mehanizme za ispravljanje pogrešaka s različitim fluorescentnim oznakama. Analiza s CLSM i SD sustavima stoga nadopunjuje mjerenja provedena s već postojećim dvofotonskim mikroskopskim sustavom. 3. U posljednjih nekoliko godina, razvojem molekularne tetovaže tehnologije, postigli smo revolucionarne rezultate u području optofarmakologije. Razvojem farmaceutskih derivata koji se mogu aktivirati svjetlom imamo priliku regulirati određene stanične biološke procese u CLSM sustavu lokalizacijom određenih mikrometara. Procesi koji kontroliraju dinamičku transformaciju aktinskih kostura živčanih stanica (npr. rast i traženje putova aksona) mogu se istražiti uz visoku prostornu i vremensku rezoluciju. MyosinII aksonski rast i protok aktinske dinamike (Croatian)
5 September 2022
0 references
Бихме искали да придобием две допълващи се микроскопични системи за извършване на наблюдения върху живи клетки, позволяващи физиологични изследвания. Системата за конфокално лазерно сканиране (CLSM) предоставя отлични възможности за флуоресцентни манипулации и измервания (фотоактивиране, фотоконверсия, фотоизбелване, Förster резонансен енергиен трансфер (FRET)); специфичността на записа на сигнала се увеличава чрез спектрално откриване. В тази система можем да съсредоточим тестовете върху по-малките области в зрителното поле, които по избор са определени. С микроскопичната система на въртящия се диск (SD) можем да записваме молекулярни процеси в живи клетки дори по-бързо от CLSM системата, дори при милисекундна скорост на запис на изображения, в цялото зрително поле. Важен аспект е, че живите клетки са обект на по-малко излагане на светлина по време на записите, така че можем да продължим наблюденията много по-дълго. SD системата, която се доставя, е подходяща и за показване на молекулярни процеси в непосредствена близост до клетъчната повърхност (на разстояние от 100—150 nm) с повишена разделителна способност и висока скорост в сравнение с CLSM тестове (TIRF, т.е. пълна вътрешна рефлефираща микроскопия). И двете системи могат да записват два флуоресцентни сигнала едновременно с 2 детектора (CLSM) и 2 камери (SD), така че молекулярните взаимодействия, промените в концентрацията и транспортните процеси в живите клетки да се проследяват специално в реално време. 14-те изследователски екипа, участващи в търга, изследват молекулярните и клетъчни физиологични ефекти на възпалителните и автоимунните заболявания, засягащи образуването на тумори и метастазите, клетъчните процеси на нервна пластичност и самостоятелното храносмилане на клетките (вж. приложените биографии). Целите са широки, но общата им характеристика е, че те имат за цел да изследват динамичните клетъчни биологични промени в живите клетки. Микроскопите, които ще бъдат възложени, осигуряват необходимите инфраструктурни условия за проучванията, а изключителният научен опит на участниците осигурява необходимата платформа за знания за изпълнение. По-долу микроскопичните техники, които трябва да се използват, са представени чрез няколко основни теми. 1. В различни имунни клетки (напр. гранулоцити, макрофаги, дендритни клетки, лимфоцити) процеси след лиганд свързване на рецепторите, „диалог“ между рецепторите играе решаваща роля в много физиологични и патологични имунни процеси. Например, сътрудничеството между рецепторите на комплемента и рецепторите за разпознаване на модели за гранулоцити, важни за възпалението, води до образуването на неутрофилни извънклетъчни капани (т.нар. NET). Промените във вътреклетъчния Ca2+ сигнал, придружаващ активирането на неутрофилите, могат да бъдат тествани с помощта на луминесцентни Ca-индикаторни мастила (напр. Fluo3/Fluo4) и генетично кодирани Ca2+ индикатори (напр. GCaMP6) както на CLSM, така и на SD системи за клетъчни линии, способни да образуват NET. TIRF микроскопията, интегрирана в SD, е от съществено значение за проследяване на адхезията и разпространението на различни имунни клетки и процеси в близост до клетъчната повърхност (напр. освобождаване на NET). Използвайки CLSM и SD системи, чрез едновременно откриване на два флуоресцентни сигнала, можем да тестваме молекулярните ефекти, които контролират функционирането на имунните клетки (напр. взаимодействие между рецепторите, вътреклетъчните транспортни процеси) в реално време, в непосредствена близост до клетъчната повърхност и успоредно с измерването на активирането. 2. Хомоложната рекомбинация е един от най-ефективните начини за коригиране на грешки в ДНК на организмите, предотвратяване на трансформацията на рака и създаване на нови генни варианти. В допълнение към ин витро подхода, ние тестваме в цели организми (червей и зебра) DNA-HELICAS, в които подпроцеси на клетъчно делене, чрез които молекулярни дейности и с кои протеинови партньори те насърчават контролирана рекомбинация, точна хромозомна сегрегация. Микроскопите, които позволяват едновременното и бързо показване на двата флуоресцентни сигнала, са от съществено значение за откриването на процеси в организми, произвеждащи протеини, които участват в механизми за коригиране на грешки с различни флуоресцентни етикети. Следователно анализът с CLSM и SD системите допълва измерванията, извършени с вече съществуващата двуфотонна микроскопична система. 3. През последните години, чрез разработване на молекулярна татуировка технология, ние постигнахме новаторски резултати в областта на оптофармакологията. С разработването на леко активирани фармацевтични производни, ние имаме възможност да регулираме определени клетъчни биологични процеси в CLSM системата чрез локализиране на определени микрометри. Процесите, които контролират динамичната трансформация на актиновите скелети на нервните клетки (напр. растеж и търсене на пътища на аксоните), могат да бъдат изследвани с висока пространствена и времева разделителн... (Bulgarian)
5 September 2022
0 references
Ba mhaith linn dhá chóras micreascópacha chomhlántacha a fháil chun breathnuithe a dhéanamh ar chealla beo, rud a ligeann do scrúduithe fiseolaíocha. Soláthraíonn an córas scanadh léasair confocal (CLSM) deiseanna den scoth le haghaidh ionramhálacha agus tomhais fhluaraiseacha (photoactivation, photo conversion, photobleaching, Förster athshondach fuinnimh (FRET)); méadaítear sainiúlacht an taifeadta comhartha trí bhrath speictreach. Sa chóras seo, is féidir linn na tástálacha a dhíriú ar na réigiúin níos lú laistigh den réimse radhairc, arna n-ainmniú go roghnach. Leis an gcóras micreascópacha diosca sníomh (SD), is féidir linn próisis mhóilíneacha a thaifeadadh i gcealla beo fiú níos tapúla ná an córas CLSM, fiú ag ráta taifeadta íomhá millisecond, i réimse iomlán na radhairc. Gné thábhachtach is ea go bhfuil cealla beo faoi réir nochtadh solais níos lú le linn na dtaifeadtaí, ionas gur féidir linn leanúint ar aghaidh leis na tuairimí i bhfad níos faide. Tá an córas SD atá le soláthar oiriúnach freisin chun próisis mhóilíneacha a thaispeáint i ngarchomharsanacht dhromchla na cille (laistigh d’achar 100-150 nm) le réiteach méadaithe agus luas ard i gcomparáid le tástálacha CLSM (TIRF, i.e. micreascópacht mhachnaimh inmheánach iomlán). Tá an dá chóras in ann dhá chomhartha fluaraiseacha a thaifeadadh ag an am céanna le 2 bhrathadóir (CLSM) agus 2 cheamara (SDanna), ionas go ndéanfar idirghníomhaíochtaí móilíneacha, athruithe tiúchana agus próisis iompair i gcealla beo a rianú go sonrach i bhfíor-am. Tá imscrúdú á dhéanamh ag na foirne taighde 14 a ghlacann páirt sa tairiscint ar na héifeachtaí móilíneacha agus fiseolaíocha cille a bhaineann le galair athlastacha agus uathimdhíonachta a théann i bhfeidhm ar fhoirmiú siadaí agus ar mheiteastasis, ar phróisis cheallacha de phlaisteacht néarógach agus ar fhéin-dhíleá na gceall (féach beathaisnéisí ceangailte). Tá na cuspóirí leathana, ach is é an ghné choiteann atá acu ná féachaint ar athruithe dinimiciúla bitheolaíocha ceall i gcealla beo. Soláthraíonn na micreascóip atá le soláthar na dálaí bonneagair is gá do na staidéir, agus soláthraíonn cúlra eolaíoch den scoth na rannpháirtithe an t-ardán eolais is gá le haghaidh cur chun feidhme. Thíos, cuirtear na teicnící micreascópacha atá le húsáid i láthair trí roinnt príomhthéamaí. 1. I gcealla imdhíonachta éagsúla (e.g. granulocytes, macrophages, cealla dendritic, limficítí) tar éis lig agus ceangal gabhdóirí, tá ról ríthábhachtach ag “idirphlé” idir gabhdóirí i go leor próisis imdhíonachta fiseolaíocha agus paiteolaíocha. Mar shampla, comhar idir gabhdóirí comhlántacha agus gabhdóirí aitheantais patrún le haghaidh gráinniúcháin atá tábhachtach in athlasadh, rud a fhágann go gcruthaítear gaistí extracellular neutrophil (ar a dtugtar NETs). Is féidir athruithe ar an comhartha idircheallach Ca2+ a ghabhann le gníomhachtú neodrófil a thástáil ag baint úsáide as dúigh fluaraiseacha Ca-táscaire (e.g. Fluo3/Fluo4) agus táscairí Ca2+ ionchódaithe go géiniteach (e.g. GCaMP6) ar chórais CLSM agus SD araon le haghaidh línte ceall atá in ann NET a fhoirmiú. Tá micreascópacht TIRF atá comhtháite in SD riachtanach chun faireachán a dhéanamh ar ghreamú agus scaipeadh ceall agus próiseas imdhíonachta éagsúil gar do dhromchla na gceall (e.g. scaoileadh NET). Trí chórais CLSM agus SD a úsáid, trí dhá chomhartha fluaraiseacha a bhrath ag an am céanna, is féidir linn tástáil a dhéanamh ar na héifeachtaí móilíneacha a rialaíonn feidhmiú cealla imdhíonachta (e.g. idirghníomhaíocht idir gabhdóirí, próisis iompair ioncheallacha) i bhfíor-am, gar do dhromchla na cille agus i gcomhthráth le tomhas gníomhachtaithe. 2. Tá recombination homalógach ar cheann de na bealaí is éifeachtaí earráidí a cheartú i DNA na n-orgánach, a chosc claochlú ailse agus a chruthú leaganacha géine nua. Chomh maith leis an gcur chuige in vitro, déanaimid tástáil ar orgánaigh iomlána (péist agus séabraigh) DNA-helicas ina bhfuil fophróisis de roinnt cille, trína gcuireann gníomhaíochtaí móilíneacha agus comhpháirtithe próitéine chun cinn athchuingriú rialaithe, deighilt chromosomal cruinn. Tá micreascóip a cheadaíonn an dá chomhartha fluaraiseacha a thaispeáint go comhuaineach agus go tapa riachtanach chun próisis a bhrath in orgánaigh a tháirgeann próitéiní a bhfuil baint acu le meicníochtaí ceartúcháin earráide le lipéid fhluaraiseacha éagsúla. Dá bhrí sin, comhlánaíonn anailís le córais CLSM agus SD na tomhais a rinneadh leis an gcóras micreascópach dhá-fótagrafach atá ann cheana féin. 3. Le blianta beaga anuas, trí theicneolaíocht tatú móilíneach a fhorbairt, ní mór dúinn torthaí úrnua a bhaint amach i réimse na optofarmaceolaíochta. Le forbairt na ndíorthach cógaisíochta éadrom-gníomhaithe, ní mór dúinn an deis a rialáil próisis bitheolaíochta cille áirithe sa chóras CLSM trí logánú micrometres áirithe. Is féidir na próisis a rialaíonn claochlú dinimiciúil cnámharlaigh actin de chealla néaróg (e.g. fás agus cuardach conairí axóin) a iniúchadh le taifeach ... (Irish)
5 September 2022
0 references
Vorremmo acquisire due sistemi microscopici complementari per eseguire osservazioni sulle cellule viventi, consentendo esami fisiologici. Il sistema di scansione laser confocale (CLSM) offre ottime opportunità per manipolazioni e misurazioni fluorescenti (fotoattivazione, fotoconversione, fotobleaching, trasferimento di energia risonante Förster (FRET)); la specificità della registrazione del segnale è aumentata dal rilevamento spettrale. In questo sistema, possiamo concentrare i test sulle regioni più piccole all'interno del campo visivo, facoltativamente designato. Con il sistema microscopico a disco di rotazione (SD), possiamo registrare i processi molecolari nelle cellule vive ancora più velocemente del sistema CLSM, anche a una velocità di registrazione dell'immagine millisecondo, nell'intero campo visivo. Un aspetto importante è che le cellule viventi sono soggette a meno esposizione alla luce durante le registrazioni, in modo da poter continuare le osservazioni molto più a lungo. Il sistema SD da acquistare è adatto anche per la visualizzazione di processi molecolari nelle immediate vicinanze della superficie cellulare (entro una distanza di 100-150 nm) con maggiore risoluzione e alta velocità rispetto ai test CLSM (TIRF, cioè microscopia a riflessione interna completa). Entrambi i sistemi sono in grado di registrare due segnali fluorescenti contemporaneamente con 2 rivelatori (CLSM) e 2 telecamere (SD), in modo che le interazioni molecolari, i cambiamenti di concentrazione e i processi di trasporto nelle cellule vive siano specificamente monitorati in tempo reale. I 14 gruppi di ricerca che partecipano al tender stanno studiando gli effetti fisiologici molecolari e cellulari delle malattie infiammatorie e autoimmuni che colpiscono la formazione e le metastasi tumorali, i processi cellulari di plasticità nervosa e l'autodigestione delle cellule (vedi biografie allegate). Gli obiettivi sono ampi, ma la loro caratteristica comune è che mirano a esplorare i cambiamenti biologici delle cellule dinamiche nelle cellule viventi. I microscopi da procurare forniscono le condizioni infrastrutturali necessarie per gli studi e l'eccezionale background scientifico dei partecipanti fornisce la piattaforma di conoscenza necessaria per l'attuazione. Di seguito, le tecniche microscopiche da utilizzare sono presentate attraverso alcuni temi principali. 1. In varie cellule immunitarie (ad es. granulociti, macrofagi, cellule dendritiche, linfociti) processi successivi al legame ligando dei recettori, il "dialogo" tra i recettori svolge un ruolo cruciale in molti processi immunitari fisiologici e patologici. Ad esempio, la cooperazione tra i recettori del complemento e i recettori di riconoscimento dei modelli per i granulociti importanti nell'infiammazione, portando alla formazione di trappole extracellulari neutrofili (i cosiddetti NET). Le variazioni del segnale intracellulare Ca2+ che accompagnano l'attivazione dei neutrofili possono essere testate utilizzando inchiostri fluorescenti Ca-indicator (ad esempio Fluo3/Fluo4) e indicatori Ca2+ geneticamente codificati (ad esempio GCaMP6) su sistemi CLSM e SD per linee cellulari in grado di formare NET. La microscopia TIRF integrata in SD è essenziale per monitorare l'adesione e la diffusione di varie cellule immunitarie e processi vicino alla superficie cellulare (ad esempio rilascio NET). Utilizzando i sistemi CLSM e SD, rilevando contemporaneamente due segnali fluorescenti, possiamo testare in tempo reale gli effetti molecolari che controllano il funzionamento delle cellule immunitarie (ad esempio l'interazione tra recettori, processi di trasporto intracellulare) in prossimità della superficie cellulare e in parallelo con la misurazione dell'attivazione. 2. La ricombinazione omologa è uno dei modi più efficaci per correggere gli errori nel DNA degli organismi, prevenire la trasformazione del cancro e creare nuove varianti geniche. Oltre all'approccio in vitro, testiamo in organismi interi (verme e pesce zebra) DNA-HELICAS in cui sub-processi di divisione cellulare, attraverso quali attività molecolari e con quali partner proteici promuovono la ricombinazione controllata, la segregazione cromosomica accurata. I microscopi che consentono la visualizzazione simultanea e rapida dei due segnali fluorescenti sono essenziali per rilevare i processi in organismi che producono proteine che sono coinvolti nei meccanismi di correzione degli errori con diverse etichette fluorescenti. L'analisi con sistemi CLSM e SD integra quindi le misurazioni effettuate con il sistema microscopico a due fotoni già esistente. 3. Negli ultimi anni, sviluppando la tecnologia del tatuaggio molecolare, abbiamo raggiunto risultati rivoluzionari nel campo dell'optofarmacologia. Con lo sviluppo di derivati farmaceutici attivabili alla luce, abbiamo l'opportunità di regolare alcuni processi biologici cellulari nel sistema CLSM localizzando alcuni micrometri. I processi che controllano la trasformazione... (Italian)
5 September 2022
0 references
Chceli by sme získať dva doplnkové mikroskopické systémy na vykonávanie pozorovaní živých buniek, čo umožní fyziologické vyšetrenie. Systém konfokálneho laserového skenovania (CLSM) poskytuje vynikajúce príležitosti pre fluorescenčné manipulácie a merania (fotoaktivácia, fotokonverzia, fotobielenie, Förster rezonančný prenos energie (FRET)); špecifickosť záznamu signálu sa zvyšuje spektrálnou detekciou. V tomto systéme môžeme testy zamerať na menšie oblasti v rámci zorného poľa, voliteľne označené. S mikroskopickým systémom spinning disku (SD) môžeme zaznamenať molekulárne procesy v živých bunkách ešte rýchlejšie ako systém CLSM, dokonca aj pri milisekundovom zázname obrazu v celom zornom poli. Dôležitým aspektom je, že živé bunky sú vystavené menšiemu vystaveniu svetla počas nahrávania, takže môžeme pokračovať v pozorovaní oveľa dlhšie. Systém SD, ktorý sa má obstarať, je vhodný aj na zobrazovanie molekulárnych procesov v bezprostrednej blízkosti povrchu bunky (vo vzdialenosti 100 – 150 nm) so zvýšeným rozlíšením a vysokou rýchlosťou v porovnaní s testami CLSM (TIRF, t. j. úplná vnútorná odrazová mikroskopia). Oba systémy sú schopné zaznamenávať dva fluorescenčné signály súčasne s 2 detektormi (CLSM) a 2 kamerami (SD), takže molekulárne interakcie, zmeny koncentrácie a transportné procesy v živých bunkách sú špecificky sledované v reálnom čase. 14 výskumných tímov zapojených do výberového konania skúma molekulárne a bunkové fyziologické účinky zápalových a autoimunitných ochorení ovplyvňujúcich tvorbu nádorov a metastáz, bunkové procesy nervovej plasticity a samotrávenie buniek (pozri priložené životopisy). Ciele sú široké, ale ich spoločným znakom je, že sa zameriavajú na skúmanie dynamických bunkových biologických zmien v živých bunkách. Mikroskopy, ktoré sa majú obstarať, poskytujú potrebné infraštruktúrne podmienky pre štúdie a vynikajúce vedecké zázemie účastníkov poskytuje potrebnú vedomostnú platformu na implementáciu. Nižšie sú mikroskopické techniky, ktoré sa majú použiť, prezentované v niekoľkých hlavných témach. 1. V rôznych imunitných bunkách (napr. granulocyty, makrofágy, dendritické bunky, lymfocyty) procesy po väzbe ligandu receptorov zohrávajú kľúčovú úlohu v mnohých fyziologických a patologických imunitných procesoch. Napríklad spolupráca medzi doplnkovými receptormi a receptormi rozpoznávania vzorov pre granulocyty dôležité pri zápale, čo vedie k tvorbe neutrofilných extracelulárnych pascí (tzv. NETs). Zmeny intracelulárneho signálu Ca2+ sprevádzajúceho aktiváciu neutrofilov sa môžu testovať pomocou fluorescenčných Ca-indikátorových atramentov (napr. Fluo3/Fluo4) a geneticky kódovaných indikátorov Ca2+ (napr. GCaMP6) na CLSM aj SD systémoch pre bunkové linky schopné tvoriť NET. Mikroskopia TIRF integrovaná v SD je nevyhnutná na monitorovanie adhézie a šírenia rôznych imunitných buniek a procesov v blízkosti povrchu buniek (napr. uvoľňovanie NET). Použitím CLSM a SD systémov, detekciou dvoch fluorescenčných signálov súčasne, môžeme otestovať molekulárne účinky, ktoré riadia fungovanie imunitných buniek (napr. interakcia medzi receptormi, intracelulárny transportný proces) v reálnom čase, v tesnej blízkosti povrchu buniek a paralelne s meraním aktivácie. 2. Homológna rekombinácia je jedným z najúčinnejších spôsobov, ako opraviť chyby v DNA organizmov, zabrániť transformácii rakoviny a vytvoriť nové génové varianty. Okrem prístupu in vitro testujeme v celých organizmoch (červy a zebrafish) DNA-HELICAS, v ktorých subprocesy bunkového delenia, prostredníctvom ktorých molekulárne aktivity a s ktorými proteín partneri podporujú kontrolovanú rekombináciu, presnú chromozómovú segregáciu. Mikroskopy, ktoré umožňujú simultánne a rýchle zobrazenie dvoch fluorescenčných signálov, sú nevyhnutné pre detekciu procesov v organizmoch produkujúcich proteíny, ktoré sa podieľajú na mechanizmoch korekcie chýb s rôznymi fluorescenčnými štítkami. Analýza so systémami CLSM a SD preto dopĺňa vykonané merania s už existujúcim dvojfotónovým mikroskopickým systémom. 3. V posledných rokoch, vývojom molekulárnej technológie tetovania, sme dosiahli prelomové výsledky v oblasti optofarmakológie. S vývojom ľahko aktivovaných farmaceutických derivátov máme možnosť regulovať určité bunkové biologické procesy v systéme CLSM lokalizáciou určitých mikrometrov. Procesy, ktoré riadia dynamickú transformáciu aktínových kostrových nervových buniek (napr. rast a hľadanie ciest axónov), môžu byť preskúmané s vysokým priestorovým a časovým rozlíšením. Rast axónu MyosinII a akínová dynamika (Slovak)
5 September 2022
0 references
Soovime omandada kaks täiendavat mikroskoopilist süsteemi elusrakkude vaatluste tegemiseks, võimaldades füsioloogilisi uuringuid. Konfokaalne laserskaneerimine (CLSM) pakub suurepäraseid võimalusi fluorestseeruvate manipulatsioonide ja mõõtmiste tegemiseks (fotoaktiveerimine, fotokonversioonid, fotopleegimine, Försteri resonantsenergia ülekanne (FRET)); signaali salvestamise spetsiifilisust suurendab spektraaltuvastus. Selles süsteemis saame keskenduda testidele vaatevälja väiksematele piirkondadele, mis on valikuliselt määratud. Pöörleva ketta (SD) mikroskoopilise süsteemiga saame salvestada molekulaarseid protsesse elusrakkudes isegi kiiremini kui CLSM-süsteem, isegi millisekundilise pildisalvestuskiirusega kogu vaateväljas. Oluline aspekt on see, et elusad rakud on salvestuste ajal vähem valgustatud, nii et saame vaatlusi palju kauem jätkata. Hangitav SD süsteem sobib ka molekulaarsete protsesside kuvamiseks rakupinna vahetus läheduses (vahemikus 100–150 nm) suurema eraldusvõime ja suure kiirusega võrreldes CLSM-katsetega (TIRF, st täielik sisemine peegeldusmikroskoopia). Mõlemad süsteemid on võimelised salvestama kahte fluorestseeruvat signaali samaaegselt kahe detektoriga (CLSM) ja kahe kaameraga (SD), nii et molekulaarseid koostoimeid, kontsentratsioonimuutusi ja transpordiprotsesse elusrakkudes jälgitakse reaalajas. Hankes osalevad 14 uurimisrühma uurivad kasvaja moodustumist ja metastaaase mõjutavate põletikuliste ja autoimmuunhaiguste molekulaar- ja raku füsioloogilist mõju, närvilise plastilisuse rakulisi protsesse ja rakkude eneseseedet (vt lisatud biograafiad). Eesmärgid on laiad, kuid nende ühine tunnus on see, et nende eesmärk on uurida rakkude dünaamilisi bioloogilisi muutusi elusrakkudes. Hangitavad mikroskoobid tagavad uuringuteks vajalikud infrastruktuuritingimused ning osalejate silmapaistev teaduslik taust annab rakendamiseks vajaliku teadmisteplatvormi. Allpool on esitatud mikroskoopilised meetodid, mida kasutatakse mõne põhiteema kaudu. 1. Mitmetes immuunrakkudes (nt granulotsüüdid, makrofaagid, dendriitrakud, lümfotsüüdid) retseptorite ligandi sidumise järgsetes protsessides on retseptorite „dialoog“ oluline roll paljudes füsioloogilistes ja patoloogilistes immuunprotsessides. Näiteks koostöö komplemendiretseptorite ja granulotsüütide mustrituvastusretseptorite vahel, mis on olulised põletikus, põhjustades neutrofiilide ekstratsellulaarsete lõksude (nn NET) moodustumist. Muutusi intratsellulaarses Ca2+ signaalis, mis kaasneb neutrofiilide aktiveerumisega, saab testida nii CLSM- kui ka SD-süsteemides nii NET-i moodustavate rakuliinide fluorestseeruvate Ca-indikaatoritega (nt Fluo3/Fluo4) ja geneetiliselt kodeeritud Ca2+ indikaatoritega (nt GCaMP6). TIRF mikroskoopia integreeritud SD on oluline jälgida haardumist ja levikut erinevate immuunrakkude ja protsesside lähedal raku pinna (nt NET release). Kasutades CLSM- ja SD-süsteeme, tuvastame samaaegselt kaks fluorestseeruvat signaali, saame testida molekulaarseid mõjusid, mis kontrollivad immuunrakkude toimimist (nt retseptorite koostoime, rakusisesed transpordiprotsessid) reaalajas, raku pinna vahetus läheduses ja paralleelselt aktiveerimise mõõtmisega. 2. Homoloogne rekombinatsioon on üks tõhusamaid viise organismide DNA vigade parandamiseks, vähi muundumise ennetamiseks ja uute geenivariantide loomiseks. Lisaks in vitro lähenemisele katsetame terveid organisme (ussid ja sebrakalad) DNA-HELICASi, kus rakkude jagunemise alamprotsessid, mille kaudu molekulaarsed tegevused ja milliste valgupartneritega nad soodustavad kontrollitud rekombinatsiooni, täpset kromosoomi segregatsiooni. Mikroskoobid, mis võimaldavad samaaegselt ja kiiresti kuvada kahte fluorestseeruvat signaali, on olulised protsesside avastamiseks organismides, mis toodavad valke, mis on seotud erinevate fluorestseerivate siltidega vigade korrigeerimise mehhanismidega. Analüüs CLSM- ja SD-süsteemidega täiendab seega mõõtmisi, mis on tehtud juba olemasoleva kahe fotoga mikroskoopilise süsteemiga. 3. Viimastel aastatel oleme molekulaarse tätoveeringutehnoloogia arendamisega saavutanud optofarmakoloogia valdkonnas murrangulisi tulemusi. Kergetoimeliste farmatseutiliste derivaatide arenguga on meil võimalus reguleerida teatud rakkude bioloogilisi protsesse CLSM-süsteemis, lokaliseerides teatud mikromeetrid. Protsesse, mis kontrollivad närvirakkude aktiini skeleti dünaamilist transformatsiooni (nt kasvamist ja aksonite raja otsimist), saab uurida suure ruumilise ja ajalise eraldusvõimega. MyosinII axon kasvu ja aktiini dünaamika voolu (Estonian)
5 September 2022
0 references
Chcielibyśmy pozyskać dwa uzupełniające się mikroskopijne systemy do wykonywania obserwacji żywych komórek, pozwalających na badania fizjologiczne. System skanowania laserowego konfokalnego (CLSM) zapewnia doskonałe możliwości manipulacji i pomiarów fluorescencyjnych (fotoaktywacja, fotokonwersja, fotobielowanie, transfer energii rezonansowej Förster (FRET)); swoistość nagrywania sygnału zwiększa się poprzez detekcję widmową. W tym systemie możemy skupić się na mniejszych regionach w polu widzenia, opcjonalnie wyznaczonych. Dzięki mikroskopijnemu systemowi wirowania dysku (SD) możemy rejestrować procesy molekularne w żywych komórkach nawet szybciej niż system CLSM, nawet z szybkością zapisu obrazu milisekundowego, w całym polu widzenia. Ważnym aspektem jest to, że żywe komórki są narażone na mniejszą ekspozycję na światło podczas nagrywania, dzięki czemu możemy kontynuować obserwacje znacznie dłużej. Zamówiony system SD nadaje się również do wyświetlania procesów molekularnych w bezpośrednim sąsiedztwie powierzchni komórki (w odległości 100-150 nm) ze zwiększoną rozdzielczością i dużą prędkością w porównaniu z testami CLSM (TIRF, czyli pełnej wewnętrznej mikroskopii odbicia). Oba systemy są zdolne do jednoczesnego rejestrowania dwóch sygnałów fluorescencyjnych z 2 detektorami (CLSM) i 2 kamerami (SD), dzięki czemu interakcje molekularne, zmiany koncentracji i procesy transportowe w żywych komórkach są specjalnie śledzone w czasie rzeczywistym. 14 zespołów badawczych uczestniczących w przetargu bada molekularne i komórkowe fizjologiczne skutki chorób zapalnych i autoimmunologicznych wpływających na powstawanie nowotworu i przerzuty, procesy komórkowe plastyczności nerwowej i samostrawność komórek (patrz załączone biografie). Cele są szerokie, ale ich wspólną cechą jest to, że mają one na celu zbadanie dynamicznych zmian biologicznych komórek w żywych komórkach. Mikroskopy, które mają być zamawiane, zapewniają niezbędne warunki infrastrukturalne dla badań, a wybitne zaplecze naukowe uczestników zapewnia niezbędną platformę wiedzy do wdrożenia. Poniżej, mikroskopijne techniki, które mają być stosowane są przedstawione w kilku głównych tematów. 1. W różnych komórkach odpornościowych (np. granulocytach, makrofagach, komórkach dendrytycznych, limfocytach) po ligandowym wiązaniu receptorów „dialog” między receptorami odgrywa kluczową rolę w wielu fizjologicznych i patologicznych procesach immunologicznych. Na przykład współpraca między receptorami dopełniaczy a receptorami rozpoznawania wzorców dla granulocytów ważnych w stanach zapalnych, prowadząca do powstawania pułapek pozakomórkowych neutrofilów (tzw. NET). Zmiany wewnątrzkomórkowego sygnału Ca2+ towarzyszącego aktywacji neutrofilu można badać za pomocą atramentów fluorescencyjnych Ca-indicator (np. Fluo3/Fluo4) i genetycznie zakodowanych wskaźników Ca2+ (np. Mikroskopia TIRF zintegrowana z SD jest niezbędna do monitorowania adhezji i rozprzestrzeniania się różnych komórek odpornościowych i procesów w pobliżu powierzchni komórki (np. uwolnienie NET). Wykorzystując systemy CLSM i SD, wykrywając jednocześnie dwa sygnały fluorescencyjne, możemy testować efekty molekularne, które kontrolują funkcjonowanie komórek odpornościowych (np. interakcje między receptorami, wewnątrzkomórkowe procesy transportowe) w czasie rzeczywistym, w bliskiej odległości od powierzchni komórki i równolegle z pomiarem aktywacji. 2. Rekombinacja homologiczna jest jednym z najskuteczniejszych sposobów korygowania błędów w DNA organizmów, zapobiegania przemianom nowotworowym i tworzenia nowych wariantów genów. Oprócz podejścia in vitro testujemy DNA-HELICAS, w którym podprocesy podziału komórek, poprzez które działania molekularne i z którymi partnerami białkowymi sprzyjają kontrolowanej rekombinacji, dokładnej segregacji chromosomalnej, testujemy DNA-HELICAS. Mikroskopy umożliwiające jednoczesne i szybkie wyświetlanie dwóch sygnałów fluorescencyjnych są niezbędne do wykrywania procesów w organizmach wytwarzających białka zaangażowane w mechanizmy korekcji błędów z różnymi etykietami fluorescencyjnymi. Analiza za pomocą systemów CLSM i SD uzupełnia zatem pomiary już istniejącym systemem mikroskopowym dwufotonowym. 3. W ostatnich latach, rozwijając technologię tatuażu molekularnego, osiągnęliśmy przełomowe wyniki w dziedzinie optofarmakologii. Wraz z rozwojem pochodnych farmaceutycznych aktywowanych światłem, mamy możliwość regulowania pewnych procesów biologicznych komórek w systemie CLSM poprzez zlokalizowanie niektórych mikrometrów. Procesy, które kontrolują dynamiczną transformację szkieletów aktyny komórek nerwowych (np. wzrost i poszukiwanie ścieżek aksonów) mogą być badane z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. MyosinII wzrost aksonów i przepływ dynamiki aktyny (Polish)
5 September 2022
0 references
Gostaríamos de adquirir dois sistemas microscópicos complementares para realizar observações em células vivas, permitindo exames fisiológicos. O sistema de digitalização confocal a laser (CLSM) oferece excelentes oportunidades para manipulações e medições fluorescentes (fotoativação, fotoconversão, fotobranqueamento, transferência de energia ressonante Förster (FRET)); a especificidade do registo do sinal é aumentada pela deteção espetral. Neste sistema, podemos focar os testes nas regiões menores dentro do campo de visão, opcionalmente designados. Com o sistema microscópico do disco giratório (SD), podemos registrar processos moleculares em células vivas ainda mais rápidos do que o sistema CLSM, mesmo a uma taxa de gravação de imagem milissegundo, em todo o campo de visão. Um aspeto importante é que as células vivas estão sujeitas a menos exposição à luz durante as gravações, para que possamos continuar as observações por muito mais tempo. O sistema SD a ser adquirido também é adequado para exibir processos moleculares na vizinhança imediata da superfície telemóvel (a uma distância de 100-150 nm) com maior resolução e alta velocidade em comparação com testes CLSM (TIRF, ou seja, microscopia de reflexão interna completa). Ambos os sistemas são capazes de gravar dois sinais fluorescentes simultaneamente com 2 detetores (CLSM) e 2 câmeras (SDs), de modo que as interações moleculares, mudanças de concentração e processos de transporte em células vivas sejam especificamente rastreados em tempo real. As 14 equipas de investigação que participam no concurso estão a investigar os efeitos fisiológicos moleculares e telemóveis de doenças inflamatórias e autoimunes que afetam a formação e metástases tumorais, os processos celulares de plasticidade nervosa e a autodigestão das células (ver biografias anexas). Os objetivos são amplos, mas sua característica comum é que eles visam explorar mudanças biológicas telemóveis dinâmicas nas células vivas. Os microscópios a serem adquiridos proporcionam as condições de infraestrutura necessárias para os estudos, e o excelente histórico científico dos participantes fornece a plataforma de conhecimento necessária para a implementação. A seguir, as técnicas microscópicas a serem utilizadas são apresentadas por meio de alguns temas principais. 1. Em vários processos de células imunes (por exemplo, granulócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos) após a ligação ligante de recetores, o «diálogo» entre recetores desempenha um papel crucial em muitos processos imunológicos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, a cooperação entre recetores do complemento e recetores de reconhecimento de padrões para granulócitos importantes na inflamação, levando à formação de armadilhas extracelulares neutrófilas (os chamados NETs). As alterações no sinal Ca2+ intracelular que acompanham a ativação de neutrófilos podem ser testadas utilizando tintas fluorescentes indicadoras de Ca (por exemplo, Fluo3/Fluo4) e indicadores Ca2+ geneticamente codificados (por exemplo, GCaMP6) em sistemas CLSM e SD para linhas celulares capazes de formar NET. A microscopia TIRF integrada no SD é essencial para monitorar a adesão e disseminação de várias células e processos imunológicos perto da superfície telemóvel (por exemplo, liberação de NET). Usando sistemas CLSM e SD, ao detetar dois sinais fluorescentes simultaneamente, podemos testar os efeitos moleculares que controlam o funcionamento das células imunes (por exemplo, interação entre recetores, processos de transporte intracelular) em tempo real, em estreita proximidade com a superfície telemóvel e em paralelo com a medição da ativação. 2. A recombinação homóloga é uma das formas mais eficazes de corrigir erros no DNA de organismos, prevenir a transformação do cancro e criar novas variantes genéticas. Além da abordagem in vitro, testamos em organismos inteiros (worm e zebrafish) DNA-HELICAS em que subprocessos de divisão telemóvel, através dos quais atividades moleculares e com quais os parceiros proteicos promovem a recombinação controlada, segregação cromossômica precisa. Microscópios que permitem a exibição simultânea e rápida dos dois sinais fluorescentes são essenciais para detetar processos em organismos produtores de proteínas envolvidas em mecanismos de correção de erros com rótulos fluorescentes diferentes. A análise com sistemas CLSM e SD complementa, portanto, as medições realizadas com o sistema microscópico de dois fotões já existente. 3. Nos últimos anos, com o desenvolvimento de tecnologia de tatuagem molecular, conseguimos resultados inovadores no campo da optofarmacologia. Com o desenvolvimento de derivados farmacêuticos leves, temos a oportunidade de regular certos processos biológicos telemóveis no sistema CLSM, localizando certos micrómetros. Os processos que controlam a transformação dinâmica dos esqueletos actin das células nervosas (por exemplo, crescimento e busca de caminhos de axônios) podem ser explorados com alta resoluçã... (Portuguese)
5 September 2022
0 references
Rádi bychom získali dva komplementární mikroskopické systémy k provádění pozorování živých buněk, což umožňuje fyziologické vyšetření. Konfokální laserové skenování (CLSM) poskytuje vynikající příležitosti pro fluorescenční manipulace a měření (fotoaktivace, fotokonverze, fotobělení, Försterův rezonanční přenos energie (FRET)); specifičnost záznamu signálu se zvyšuje spektrální detekcí. V tomto systému můžeme testy zaměřit na menší oblasti v rámci zorného pole, volitelně označené. Díky mikroskopickému systému pro spřádání disků (SD) dokážeme zaznamenávat molekulární procesy v živých buňkách ještě rychleji než systém CLSM, a to i při milisekundové rychlosti záznamu obrazu v celém zorném poli. Důležitým aspektem je, že živé buňky jsou vystaveny menší světelné expozici během nahrávek, takže můžeme pokračovat v pozorování mnohem déle. SD systém, který má být pořízen, je také vhodný pro zobrazení molekulárních procesů v bezprostřední blízkosti povrchu buňky (ve vzdálenosti 100–150 nm) se zvýšeným rozlišením a vysokou rychlostí ve srovnání se zkouškami CLSM (TIRF, tj. plná vnitřní reflexní mikroskopie). Oba systémy jsou schopny zaznamenávat dva fluorescenční signály současně se dvěma detektory (CLSM) a dvěma kamerami (SD), takže molekulární interakce, změny koncentrace a transportní procesy v živých buňkách jsou specificky sledovány v reálném čase. 14 výzkumných týmů účastnících se výběrového řízení zkoumá molekulární a buněčné fyziologické účinky zánětlivých a autoimunitních onemocnění ovlivňujících tvorbu a metastázy nádorů, buněčné procesy nervové plasticity a vlastní trávení buněk (viz připojené životopisy). Cíle jsou široké, ale jejich společným rysem je, že se zaměřují na zkoumání dynamických buněčných biologických změn v živých buňkách. Mikroskopy, které mají být pořízeny, poskytují nezbytné infrastrukturní podmínky pro studie a vynikající vědecké zázemí účastníků poskytuje nezbytnou znalostní platformu pro realizaci. Níže jsou mikroskopické techniky, které mají být použity, prezentovány prostřednictvím několika hlavních témat. 1. V různých imunitních buňkách (např. granulocyty, makrofágy, dendritické buňky, lymfocyty) po ligandové vazbě receptorů hraje „dialog“ mezi receptory klíčovou roli v mnoha fyziologických a patologických imunitních procesech. Například spolupráce mezi komplementovými receptory a receptory rozpoznávání vzorů pro granulocyty důležité při zánětu, což vede k tvorbě neutrofilních extracelulárních pastí (tzv. NET). Změny intracelulárního signálu Ca2+ doprovázejícího aktivaci neutrofilů lze testovat pomocí fluorescenčních Ca-indikorových inkoustů (např. Fluo3/Fluo4) a geneticky kódovaných indikátorů Ca2+ (např. GCaMP6) na CLSM i SD systémech pro buněčné linie schopné vytvářet NET. TIRF mikroskopie integrovaná do SD je nezbytná pro sledování adheze a šíření různých imunitních buněk a procesů v blízkosti buněčného povrchu (např. uvolňování NET). Pomocí CLSM a SD systémů detekce dvou fluorescenčních signálů současně, můžeme testovat molekulární účinky, které řídí fungování imunitních buněk (např. interakce mezi receptory, intracelulární transportní procesy) v reálném čase, v těsné blízkosti buněčného povrchu a souběžně s měřením aktivace. 2. Homologní rekombinace je jedním z nejúčinnějších způsobů, jak opravit chyby v DNA organismů, předcházet rakovinné transformaci a vytvářet nové genové varianty. Kromě přístupu in vitro testujeme DNA-HELICAS na celých organismech (červ a zebrafish), ve kterých dílčích procesech buněčného dělení, prostřednictvím kterých molekulárních aktivit a s jakými proteinovými partnery podporují řízenou rekombinaci, přesnou chromozomální segregaci. Mikroskopy, které umožňují simultánní a rychlé zobrazení obou fluorescenčních signálů, jsou nezbytné pro detekci procesů v organismech produkujících proteiny, které se podílejí na mechanismech korekce chyb s různými fluorescenčními štítky. Analýza se systémy CLSM a SD proto doplňuje provedená měření s již existujícím dvoufotonovým mikroskopickým systémem. 3. V posledních letech jsme díky vývoji technologie molekulárního tetování dosáhli průlomových výsledků v oblasti optofarmakologie. S rozvojem lehkých farmaceutických derivátů máme možnost regulovat určité buněčné biologické procesy v systému CLSM lokalizací určitých mikrometrů. Procesy, které řídí dynamickou transformaci aktinových koster nervových buněk (např. růst a hledání cest axonů), mohou být prozkoumány s vysokým prostorovým a časovým rozlišením. Růst MyosinII axonu a actin dynamika toku (Czech)
5 September 2022
0 references
Vi ønsker at erhverve to komplementære mikroskopiske systemer til at udføre observationer på levende celler, der giver mulighed for fysiologiske undersøgelser. Det konfokale laserscanningssystem (CLSM) giver fremragende muligheder for fluorescerende manipulationer og målinger (fotoaktivering, fotokonvertering, fotoblegning, Förster resonansenergioverførsel (FRET)); signaloptagelsens specificitet øges ved spektraldetektering. I dette system kan vi fokusere testene på de mindre områder inden for synsfeltet, eventuelt udpeget. Med spinding disc (SD) mikroskopiske system, kan vi registrere molekylære processer i levende celler endnu hurtigere end CLSM-systemet, selv ved en millisekunder billedoptagelseshastighed, i hele synsfeltet. Et vigtigt aspekt er, at levende celler er udsat for mindre lyseksponering under optagelserne, så vi kan fortsætte observationerne meget længere. Det SD-system, der skal indkøbes, er også egnet til visning af molekylære processer i umiddelbar nærhed af celleoverfladen (inden for en afstand af 100-150 nm) med øget opløsning og høj hastighed sammenlignet med CLSM-test (TIRF, dvs. fuld intern refleksionsmikroskopi). Begge systemer er i stand til at optage to fluorescerende signaler samtidig med 2 detektorer (CLSM) og 2 kameraer (SD'er), således at molekylære interaktioner, koncentrationsændringer og transportprocesser i levende celler specifikt spores i realtid. De 14 forskerhold, der deltager i udbuddet, undersøger de molekylære og cellefysiologiske virkninger af inflammatoriske og autoimmune sygdomme, der påvirker tumordannelse og metastaser, cellulære processer af nervøs plasticitet og selvfordøjelse af celler (se vedlagte biografier). Målene er brede, men deres fælles træk er, at de sigter mod at udforske dynamiske celle biologiske ændringer i levende celler. De mikroskoper, der skal indkøbes, giver de nødvendige infrastrukturelle betingelser for undersøgelserne, og deltagernes fremragende videnskabelige baggrund giver den nødvendige vidensplatform til gennemførelse. Nedenfor præsenteres de mikroskopiske teknikker, der skal anvendes, gennem et par hovedtemaer. 1. I forskellige immunceller (f.eks. granulocytter, makrofager, dendritiske celler, lymfocytter) efter ligandbinding af receptorer spiller "dialog" mellem receptorer en afgørende rolle i mange fysiologiske og patologiske immunprocesser. For eksempel samarbejde mellem komplementreceptorer og mønstergenkendelsesreceptorer for granulocytter, der er vigtige i inflammation, hvilket fører til dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (såkaldte NET'er). Ændringer i det intracellulære Ca2±signal, der ledsager neutrofilaktivering, kan testes ved hjælp af fluorescerende Ca-indikatorfarver (f.eks. Fluo3/Fluo4) og genetisk kodede Ca2±indikatorer (f.eks. GCaMP6) på både CLSM- og SD-systemer til cellelinjer, der er i stand til at danne NET. TIRF-mikroskopi integreret i SD er afgørende for at overvåge adhæsion og spredning af forskellige immunceller og processer nær celleoverfladen (f.eks. NET-frigivelse). Ved at bruge CLSM- og SD-systemer, ved at detektere to fluorescerende signaler samtidig, kan vi teste de molekylære effekter, der styrer immuncellernes funktion (f.eks. interaktion mellem receptorer, intracellulære transportprocesser) i realtid, i umiddelbar nærhed af celleoverfladen og parallelt med aktiveringsmålingen. 2. Homolog rekombination er en af de mest effektive måder at korrigere fejl i DNA af organismer, forebygge kræft transformation og skabe nye genvarianter. Ud over in vitro-metoden tester vi i hele organismer (orm og zebrafisk) DNA-HELICAS, hvorigennem delprocesser af celledeling, hvorigennem molekylære aktiviteter og med hvilke proteinpartnere de fremmer kontrolleret rekombination, nøjagtig kromosomal segregation. Mikroskoper, der muliggør samtidig og hurtig visning af de to fluorescerende signaler, er afgørende for påvisning af processer i organismer, der producerer proteiner, der er involveret i fejlkorrektionsmekanismer med forskellige fluorescerende etiketter. Analyse med CLSM- og SD-systemer supplerer derfor de målinger, der udføres med det allerede eksisterende tofotonmikroskopsystem. 3. I de senere år har vi ved at udvikle molekylær tatoveringsteknologi opnået banebrydende resultater inden for optofarmakologi. Med udviklingen af letaktiverbare lægemiddelderivater har vi mulighed for at regulere visse cellebiologiske processer i CLSM-systemet ved at lokalisere visse mikrometer. De processer, der styrer den dynamiske transformation af aktinske skeletter i nerveceller (f.eks. vækst og søgen efter stier af axoner) kan udforskes med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. MyosinII axon vækst og aktin dynamik flow (Danish)
5 September 2022
0 references
Vi skulle vilja förvärva två kompletterande mikroskopiska system för att utföra observationer på levande celler, vilket möjliggör fysiologiska undersökningar. Det konfokala laserskanningssystemet (CLSM) ger utmärkta möjligheter för fluorescerande manipulationer och mätningar (fotoaktivering, fotokonvertering, fotoblekning, Förster resonant energiöverföring (FRET)); signalinspelningens specificitet ökar genom spektraldetektering. I detta system kan vi fokusera testerna på de mindre regionerna inom synfältet, eventuellt utsedda. Med spinnskivan (SD) mikroskopiska systemet kan vi spela in molekylära processer i levande celler ännu snabbare än CLSM-systemet, även vid en millisekunders bildinspelningshastighet, i hela synfältet. En viktig aspekt är att levande celler utsätts för mindre ljusexponering under inspelningarna, så vi kan fortsätta observationerna mycket längre. Det SD-system som ska anskaffas är också lämpligt för visning av molekylära processer i omedelbar närhet av cellytan (inom ett avstånd av 100–150 nm) med ökad upplösning och hög hastighet jämfört med CLSM-tester (TIRF, dvs. fullständig intern reflektionsmikroskopi). Båda systemen kan registrera två fluorescerande signaler samtidigt med 2 detektorer (CLSM) och 2 kameror (SD), så att molekylära interaktioner, koncentrationsförändringar och transportprocesser i levande celler specifikt spåras i realtid. De 14 forskarlag som deltar i anbudet undersöker de molekylära och cellfysiologiska effekterna av inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar som påverkar tumörbildning och metastaser, cellulära processer av nervös plasticitet och självsmältning av celler (se bifogade biografier). Målen är breda, men deras gemensamma drag är att de syftar till att utforska dynamiska cellbiologiska förändringar i levande celler. De mikroskop som ska upphandlas ger de nödvändiga infrastrukturella förutsättningarna för studierna, och deltagarnas enastående vetenskapliga bakgrund ger den nödvändiga kunskapsplattformen för genomförande. Nedan presenteras de mikroskopiska tekniker som ska användas genom några huvudteman. 1. I olika immunceller (t.ex. granulocyter, makrofager, dendritiska celler, lymfocyter) efter ligandbindning av receptorer spelar ”dialog” mellan receptorer en avgörande roll i många fysiologiska och patologiska immunprocesser. Till exempel samarbete mellan komplementreceptorer och mönsterigenkänningsreceptorer för granulocyter som är viktiga vid inflammation, vilket leder till bildandet av extracellulära neutrofila fällor (så kallade NET). Förändringar i den intracellulära Ca2±signalen som åtföljer neutrofilaktivering kan testas med hjälp av fluorescerande Ca-indikatorbläck (t.ex. Fluo3/Fluo4) och genetiskt kodade Ca2±indikatorer (t.ex. GCaMP6) på både CLSM- och SD-system för celllinjer som kan bilda NET. TIRF-mikroskopi integrerad i SD är viktigt för att övervaka vidhäftningen och spridningen av olika immunceller och processer nära cellytan (t.ex. NET-frisättning). Genom att använda CLSM och SD-system, genom att detektera två fluorescerande signaler samtidigt, kan vi testa de molekylära effekter som styr immuncellernas funktion (t.ex. interaktion mellan receptorer, intracellulära transportprocesser) i realtid, i närheten av cellytan och parallellt med mätningen av aktivering. 2. Homolog rekombination är ett av de mest effektiva sätten att korrigera fel i organismernas DNA, förebygga canceromvandling och skapa nya genvarianter. Förutom in vitro-metoden testar vi i hela organismer (mask och zebrafisk) DNA-HELICAS i vilka underprocesser av celldelning, genom vilka molekylära aktiviteter och med vilka proteinpartners de främjar kontrollerad rekombination, korrekt kromosomsegregering. Mikroskop som tillåter samtidig och snabb visning av de två fluorescerande signalerna är nödvändiga för att detektera processer i organismer som producerar proteiner som är involverade i felkorrigeringsmekanismer med olika fluorescerande etiketter. Analys med CLSM och SD-system kompletterar därför mätningarna med det redan befintliga mikroskopiska tvåfotonsystemet. 3. Under de senaste åren, genom att utveckla molekylär tatueringsteknik, har vi uppnått banbrytande resultat inom optofarmacology. Med utvecklingen av lättaktiverade farmaceutiska derivat har vi möjlighet att reglera vissa cellbiologiska processer i CLSM-systemet genom att lokalisera vissa mikrometer. De processer som styr den dynamiska omvandlingen av aktinskeletterna i nervceller (t.ex. tillväxt och sökande efter vägar av axoner) kan utforskas med hög rumslig och temporal upplösning. MyosinII axon tillväxt och aktin dynamik flöde (Swedish)
5 September 2022
0 references
Radi bi pridobili dva komplementarna mikroskopska sistema za izvajanje opazovanj živih celic, kar omogoča fiziološke preiskave. Sistem za optično lasersko skeniranje (CLSM) zagotavlja odlične možnosti za fluorescenčne manipulacije in meritve (fotoaktivacija, fotokonverzija, fotobeljenje, Förster resonančni prenos energije (FRET)); specifičnost snemanja signala se poveča s spektralno detekcijo. V tem sistemu se lahko preizkuse osredotočimo na manjše regije v vidnem polju, ki so neobvezno označene. Z mikroskopskim sistemom vrtljivega diska (SD) lahko molekularne procese v živih celicah snemamo še hitreje kot sistem CLSM, tudi pri milisekundni hitrosti snemanja slik v celotnem vidnem polju. Pomemben vidik je, da so žive celice med snemanjem izpostavljene manjši izpostavljenosti svetlobi, zato lahko opazovanja nadaljujemo veliko dlje. Sistem SD, ki ga je treba pridobiti, je primeren tudi za prikaz molekularnih procesov v neposredni bližini površine celice (na razdalji 100–150 nm) s povečano ločljivostjo in visoko hitrostjo v primerjavi s testi CLSM (TIRF, tj. popolna notranja odbojna mikroskopija). Oba sistema lahko snemata dva fluorescenčna signala hkrati z dvema detektorjema (CLSM) in 2 kamerama (SD), tako da se molekularne interakcije, spremembe koncentracije in transportni procesi v živih celicah natančno spremljajo v realnem času. 14 raziskovalnih skupin, ki sodelujejo v razpisu, raziskuje molekularne in celične fiziološke učinke vnetnih in avtoimunskih bolezni, ki vplivajo na nastanek tumorjev in metastaze, celične procese živčne plastičnosti in samoprebavo celic (glej priložene biografije). Cilji so široki, vendar njihova skupna značilnost je, da si prizadevajo raziskati dinamične celične biološke spremembe v živih celicah. Mikroskopi, ki jih je treba naročiti, zagotavljajo potrebne infrastrukturne pogoje za študije, izjemno znanstveno ozadje udeležencev pa zagotavlja potrebno platformo znanja za izvajanje. Spodaj so mikroskopske tehnike, ki jih je treba uporabiti, predstavljene v nekaj glavnih temah. 1. V različnih imunskih celicah (npr. granulociti, makrofagi, dendritične celice, limfociti) po vezavi receptorjev ligand ima „dialog“ med receptorji ključno vlogo v številnih fizioloških in patoloških imunskih procesih. Na primer, sodelovanje med receptorji komplementa in receptorji za prepoznavanje vzorcev za granulocite, ki so pomembni pri vnetju, kar vodi do nastanka nevtrofilcev zunajceličnih pasti (t. i. NET). Spremembe znotrajceličnega signala Ca2+, ki spremlja aktivacijo nevtrofilcev, se lahko preskusijo s fluorescenčnimi Ca-indicatorskimi črnili (npr. Fluo3/Fluo4) in genetsko kodiranimi Ca2+ kazalniki (npr. GCaMP6) na sistemih CLSM in SD za celične linije, ki lahko tvorijo NET. Mikroskopija TIRF, integrirana v SD, je bistvena za spremljanje adhezije in širjenja različnih imunskih celic in procesov v bližini površine celice (npr. sproščanje NET). Z uporabo sistemov CLSM in SD lahko s hkratnim zaznavanjem dveh fluorescenčnih signalov testiramo molekularne učinke, ki nadzorujejo delovanje imunskih celic (npr. interakcija med receptorji, znotrajcelični transportni procesi) v realnem času, v neposredni bližini celične površine in vzporedno z merjenjem aktivacije. 2. Homologna rekombinacija je eden najučinkovitejših načinov za odpravljanje napak v DNK organizmov, preprečevanje transformacije raka in ustvarjanje novih genskih različic. Poleg pristopa in vitro testiramo tudi na celih organizmih (worm in zebrafish) DNA-HELICAS, v katerih podprocesi celične delitve, skozi katere molekularne aktivnosti in s katerimi beljakovinskimi partnerji spodbujajo nadzorovano rekombinacijo, natančno kromosomsko segregacijo. Mikroskopi, ki omogočajo hkratno in hitro prikazovanje dveh fluorescenčnih signalov, so bistveni za odkrivanje procesov v organizmih, ki proizvajajo beljakovine, ki so vključeni v mehanizme za odpravljanje napak z različnimi fluorescenčnimi nalepkami. Analiza s sistemi CLSM in SD zato dopolnjuje meritve, izvedene z že obstoječim dvofotonskim mikroskopskim sistemom. 3. V zadnjih letih smo z razvojem molekularne tehnologije tetovaže dosegli prelomne rezultate na področju optofarmakologije. Z razvojem svetlobno aktivnih farmacevtskih derivatov imamo možnost regulirati določene celične biološke procese v sistemu CLSM z lokalizacijo določenih mikrometrov. Procese, ki nadzorujejo dinamično transformacijo aktinskih skeletov živčnih celic (npr. rast in iskanje poti aksonov), je mogoče raziskati z visoko prostorsko in časovno ločljivostjo. MyosinII aksonska rast in dinamika aktina (Slovenian)
5 September 2022
0 references
Haluaisimme hankkia kaksi täydentävää mikroskooppista järjestelmää, joiden avulla voidaan tehdä eläviä soluja koskevia havaintoja, jotka mahdollistavat fysiologiset tutkimukset. Konfoktiivisen laserskannauksen (CLSM) järjestelmä tarjoaa erinomaiset mahdollisuudet fluoresoivaan manipulointiin ja mittauksiin (fotoaktivointi, valokonversio, valovalkaisu, Försterin resonanssienergian siirto (FRET)); signaalin tallennuksen spesifisyyttä lisätään spektritunnistuksella. Tässä järjestelmässä voimme keskittää testit näkökentän pienempiin alueisiin, jotka on valinnaisesti nimetty. Pyörivällä levyllä (SD) mikroskooppisella järjestelmällä voimme tallentaa molekyyliprosesseja elävissä soluissa jopa nopeammin kuin CLSM-järjestelmä, jopa millisekunnin kuvan tallennusnopeudella, koko näkökentässä. Tärkeä näkökohta on, että elävät solut altistuvat vähemmän valolle tallenteiden aikana, joten voimme jatkaa havaintoja paljon kauemmin. Hankittava SD-järjestelmä soveltuu myös molekyyliprosessien näyttämiseen solun pinnan välittömässä läheisyydessä (etäisyydellä 100–150 nm), kun tarkkuus ja nopeus ovat korkeammat kuin CLSM-testeissä (TIRF, eli täysin sisäinen heijastusmikroskopia). Molemmat järjestelmät pystyvät tallentamaan kaksi loistesignaalia samanaikaisesti kahden ilmaisimen (CLSM) ja kahden kameran (SD) kanssa, joten molekyylivuorovaikutuksia, pitoisuusmuutoksia ja kuljetusprosesseja seurataan reaaliajassa. Tarjouskilpailuun osallistuvat 14 tutkimusryhmää tutkivat tulehdus- ja autoimmuunisairauksien molekyyli- ja solufysiologisia vaikutuksia, jotka vaikuttavat kasvainten muodostumiseen ja etäpesäkkeeseen, hermoston plastisuuden soluprosesseihin ja solujen itsesulatukseen (ks. liitteenä olevat elämäkerrat). Tavoitteet ovat laajat, mutta niiden yhteinen piirre on, että ne pyrkivät tutkimaan elävien solujen dynaamisia biologisia muutoksia. Hankittavat mikroskoopit tarjoavat tarvittavat infrastruktuuriolosuhteet tutkimuksille, ja osallistujien erinomainen tieteellinen tausta tarjoaa tarvittavan tietoalustan täytäntöönpanoa varten. Alla käytetään mikroskooppisia tekniikoita, joita esitellään muutamien pääteemojen kautta. 1. Erilaisissa immuunisoluissa (esim. granulosyytit, makrofagit, dendriittisolut, lymfosyytit) reseptorien sitoutumisen jälkeisissä prosesseissa reseptorien välinen ”dialogi” on ratkaisevassa asemassa monissa fysiologisissa ja patologisissa immuuniprosesseissa. Esimerkiksi tulehduksessa tärkeiden granulosyyttien komplementtireseptorien ja kuvioiden tunnistamisreseptorien välinen yhteistyö johtaa neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen (ns. NETs) muodostumiseen. Neutrofiiliaktivaatioon liittyvän solunsisäisen Ca2±signaalin muutoksia voidaan testata fluoresoivilla Ca-indicator-musteilla (esim. Fluo3/Fluo4) ja geneettisesti koodatuilla Ca2±indikaattoreilla (esim. GCaMP6) sekä CLSM- että SD-järjestelmissä NET:n muodostaviin solulinjoihin. SD:ään integroitu TIRF-mikroskopia on välttämätöntä erilaisten immuunisolujen ja prosessien tarttumisen ja leviämisen seuraamiseksi solun pinnan lähellä (esim. NET-vapautuminen). Käyttämällä CLSM- ja SD-järjestelmiä, havaitsemalla kaksi fluoresoivaa signaalia samanaikaisesti, voimme testata molekyylivaikutuksia, jotka ohjaavat immuunisolujen toimintaa (esim. reseptorien vuorovaikutus, solunsisäiset kuljetusprosessit) reaaliajassa, lähellä solun pintaa ja rinnakkain aktivaatiomittauksen kanssa. 2. Homologinen rekombinaatio on yksi tehokkaimmista tavoista korjata virheitä organismien DNA: ssa, estää syövän muuntumista ja luoda uusia geenivariantteja. In vitro -lähestymistavan lisäksi testaamme kokonaisia organismeja (matoja ja seeprakaloja) DNA-HELICAS-aineita, joissa solunjakautumisen osaprosessit, joiden avulla molekyylitoiminnot ja mitkä proteiinikumppanit edistävät kontrolloitua rekombinaatiota, tarkkaa kromosomisegregaatiota. Mikroskoopit, jotka mahdollistavat kahden fluoresoivan signaalin samanaikaisen ja nopean näkymisen, ovat välttämättömiä sellaisten organismien prosessien havaitsemiseksi, jotka tuottavat proteiineja, jotka ovat mukana virheiden korjausmekanismeissa, joissa on eri fluoresoiva etiketti. Näin ollen analyysi CLSM- ja SD-järjestelmillä täydentää jo olemassa olevalla kaksifotonimikroskooppisella järjestelmällä tehtyjä mittauksia. 3. Viime vuosina, kehittämällä molekyylitatuointitekniikkaa, olemme saavuttaneet uraauurtavia tuloksia optofarmakologian alalla. Valovaikutteisten farmaseuttisten johdannaisten kehittymisen myötä meillä on mahdollisuus säädellä tiettyjä solubiologisia prosesseja CLSM-järjestelmässä paikantamalla tietyt mikrometrit. Prosesseja, jotka ohjaavat hermosolujen aktiinin luurankojen dynaamista muutosta (esim. kasvua ja aksonien polkujen etsimistä), voidaan tutkia korkealla tila- ja ajallisella resoluutiolla. MyosinII akson kasvu ja aktiin dynamiikka virtaus (Finnish)
5 September 2022
0 references
Nixtiequ niksbu żewġ sistemi mikroskopiċi komplementari biex inwettqu osservazzjonijiet fuq iċ-ċelloli ħajjin, li jippermettu eżamijiet fiżjoloġiċi. Is-sistema confocal laser scanning (CLSM) tipprovdi opportunitajiet eċċellenti għal manipulazzjonijiet u kejl fluworexxenti (fotoattivazzjoni, fotokonverżjoni, photobleaching, trasferiment ta’ enerġija reżonanti Förster (FRET)); l-ispeċifiċità tar-reġistrazzjoni tas-sinjal tiżdied b’detezzjoni spettrali. F’din is-sistema, nistgħu niffukaw it-testijiet fuq ir-reġjuni ż-żgħar fi ħdan il-kamp viżiv, magħżula b’mod fakultattiv. Bid-diska għażil (SD) sistema mikroskopika, nistgħu jirreġistraw proċessi molekulari fiċ-ċelloli ħajjin saħansitra aktar mgħaġġla mis-sistema CLSM, anke b’rata ta ‘reġistrazzjoni ta’ immaġni millisekondi, fil-kamp kollu tal-viżjoni. Aspett importanti huwa li ċ-ċelloli ħajjin huma soġġetti għal inqas espożizzjoni għad-dawl matul ir-reġistrazzjonijiet, għalhekk nistgħu nkomplu l-osservazzjonijiet ħafna itwal. Is-sistema SD li għandha tiġi akkwistata hija adattata wkoll għall-wiri ta’ proċessi molekulari fil-viċinanza immedjata tas-superfiċje taċ-ċellula (f’distanza ta’ 100–150 nm) b’riżoluzzjoni miżjuda u b’veloċità għolja meta mqabbla mat-testijiet CLSM (TIRF, jiġifieri mikroskopija ta’ riflessjoni interna sħiħa). Iż-żewġ sistemi huma kapaċi jirreġistraw żewġ sinjali fluworexxenti simultanjament ma’ 2 ditekters (CLSM) u 2 kameras (SDs), sabiex l-interazzjonijiet molekulari, il-bidliet fil-konċentrazzjoni u l-proċessi tat-trasport fiċ-ċelloli ħajjin jiġu speċifikament intraċċati f’ħin reali. L-14-il tim ta’ riċerka li pparteċipaw fis-sejħa għall-offerti qed jinvestigaw l-effetti fiżjoloġiċi molekulari u taċ-ċelloli ta’ mard infjammatorju u awtoimmuni li jaffettwa l-formazzjoni tat-tumur u l-metastasi, il-proċessi ċellulari tal-plastiċità nervuża u l-awtodiġestjoni taċ-ċelloli (ara l-bijografiji mehmuża). L-objettivi huma wesgħin, iżda l-karatteristika komuni tagħhom hija li għandhom l-għan li jesploraw bidliet bijoloġiċi dinamiċi taċ-ċelloli fiċ-ċelloli ħajjin. Il-mikroskopji li għandhom jiġu akkwistati jipprovdu l-kundizzjonijiet infrastrutturali meħtieġa għall-istudji, u l-isfond xjentifiku pendenti tal-parteċipanti jipprovdi l-pjattaforma ta’ għarfien meħtieġa għall-implimentazzjoni. Hawn taħt, it-tekniki mikroskopiċi li għandhom jintużaw huma ppreżentati permezz ta’ ftit temi ewlenin. 1. F’diversi ċelloli immuni (eż. granuloċiti, makrofaġi, ċelluli dendritiċi, limfoċiti) proċessi wara t-twaħħil ta’ ligand tar-riċetturi, “djalogu” bejn ir-riċetturi għandhom rwol kruċjali f’ħafna proċessi immuni fiżjoloġiċi u patoloġiċi. Pereżempju, kooperazzjoni bejn ir-riċetturi komplementari u r-riċetturi li jagħrfu l-mudell għal granuloċiti importanti fl-infjammazzjoni, li twassal għall-formazzjoni ta’ nases ekstraċellulari tan-newtrofili (l-hekk imsejħa NETs). Bidliet fis-sinjal Ca2+ intraċellulari li jakkumpanja l-attivazzjoni tan-newtrofili jistgħu jiġu ttestjati bl-użu ta’ indikaturi fluworexxenti tal-indikatur Ca (eż. Fluo3/Fluo4) u indikaturi Ca2+ kodifikati ġenetikament (eż. GCaMP6) kemm fuq sistemi CLSM kif ukoll fuq sistemi SD għal linji ta’ ċelloli li kapaċi jiffurmaw NET. Il-mikroskopija TIRF integrata fl-SD hija essenzjali għall-monitoraġġ tal-adeżjoni u t-tixrid ta’ diversi ċelloli u proċessi immuni ħdejn il-wiċċ taċ-ċellola (eż. rilaxx NET). Bl-użu ta’ sistemi CLSM u SD, billi niskopru żewġ sinjali fluworexxenti simultanjament, nistgħu nittestjaw l-effetti molekulari li jikkontrollaw il-funzjonament taċ-ċelloli immuni (eż. interazzjoni bejn ir-riċetturi, proċessi ta’ trasport intraċellulari) f’ħin reali, qrib ħafna tal-wiċċ taċ-ċellola u b’mod parallel mal-kejl tal-attivazzjoni. 2. Ir-rikombinazzjoni omologa hija waħda mill-aktar modi effettivi ta’ korrezzjoni tal-iżbalji fid-DNA tal-organiżmi, il-prevenzjoni tat-trasformazzjoni tal-kanċer u l-ħolqien ta’ varjanti ġodda tal-ġeni. Minbarra l-approċċ in vitro, aħna nittestjaw f’organiżmi sħaħ (dud u żebra) DNA-HELICAS li fihom sottoproċessi tad-diviżjoni taċ-ċelloli, li permezz tagħhom attivitajiet molekulari u li magħhom l-imsieħba tal-proteini jippromwovu rikombinazzjoni kkontrollata, segregazzjoni kromosomali preċiża. Il-mikroskopji li jippermettu l-wiri simultanju u rapidu taż-żewġ sinjali fluworexxenti huma essenzjali biex jinstabu proċessi f’organiżmi li jipproduċu proteini li huma involuti f’mekkaniżmi ta’ korrezzjoni tal-iżbalji b’tikketti fluworexxenti differenti. L-analiżi b’sistemi CLSM u SD għalhekk tikkumplimenta l-kejl imwettaq bis-sistema mikroskopika b’żewġ ritratti li diġà teżisti. 3. F’dawn l-aħħar snin, bl-iżvilupp tat-teknoloġija tatwaġġ molekulari, ksibna riżultati rivoluzzjonarji fil-qasam tal-optofarmacology. Bl-iżvilupp ta’ derivattivi farmaċewtiċi li jistgħu jiġu attivati b’mod ħafif, għandna l-opportunità li nirregolaw ċerti proċessi bijoloġiċi taċ-ċelloli fis-sistema CLSM billi nillokalizzaw ċerti mikrometri. Il-proċessi li jikkontrollaw it-trasformazzjoni dinami... (Maltese)
5 September 2022
0 references
We willen twee complementaire microscopische systemen verwerven om observaties op levende cellen uit te voeren, waardoor fysiologische onderzoeken mogelijk zijn. Het confocal laser scanning (CLSM) systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor fluorescerende manipulaties en metingen (fotoactivering, fotoconversie, fotobleaching, Förster resonant energy transfer (FRET)); de specificiteit van de signaalopname wordt verhoogd door spectrale detectie. In dit systeem kunnen we de tests richten op de kleinere regio’s binnen het gezichtsveld, optioneel aangewezen. Met het spinning disc (SD) microscopisch systeem kunnen we moleculaire processen in levende cellen zelfs sneller registreren dan het CLSM-systeem, zelfs met een milliseconde beeldopnamesnelheid, in het hele gezichtsveld. Een belangrijk aspect is dat levende cellen tijdens de opnames minder licht worden blootgesteld, zodat we de waarnemingen veel langer kunnen voortzetten. Het aan te schaffen SD-systeem is ook geschikt voor het weergeven van moleculaire processen in de onmiddellijke nabijheid van het celoppervlak (binnen een afstand van 100-150 nm) met een hogere resolutie en hoge snelheid in vergelijking met CLSM-tests (TIRF, d.w.z. volledige interne reflectiemicroscopie). Beide systemen zijn in staat om twee fluorescerende signalen gelijktijdig op te nemen met 2 detectoren (CLSM) en 2 camera’s (SD’s), zodat moleculaire interacties, concentratieveranderingen en transportprocessen in levende cellen specifiek in realtime worden gevolgd. De 14 onderzoeksteams die deelnemen aan de tender onderzoeken de moleculaire en celfysiologische effecten van inflammatoire en auto-immuunziekten die tumorvorming en metastase, cellulaire processen van nerveuze plasticiteit en de zelfvertering van cellen beïnvloeden (zie bijgevoegde biografieën). De doelstellingen zijn breed, maar hun gemeenschappelijke kenmerk is dat ze gericht zijn op het verkennen van dynamische cel biologische veranderingen in levende cellen. De aan te schaffen microscopen bieden de nodige infrastructurele voorwaarden voor de studies en de uitstekende wetenschappelijke achtergrond van de deelnemers biedt het nodige kennisplatform voor de uitvoering. Hieronder worden de te gebruiken microscopische technieken gepresenteerd door middel van een paar hoofdthema’s. 1. In verschillende immuuncellen (bijvoorbeeld granulocyten, macrofagen, dendritische cellen, lymfocyten) na ligandbinding van receptoren, speelt „dialoog” tussen receptoren een cruciale rol in veel fysiologische en pathologische immuunprocessen. Bijvoorbeeld, samenwerking tussen complementreceptoren en patroonherkenningsreceptoren voor granulocyten die belangrijk zijn bij ontstekingen, wat leidt tot de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (zogenaamde NET’s). Veranderingen in het intracellulaire Ca2±signaal bij activering van neutrofielen kunnen worden getest met behulp van fluorescerende Ca-indicator inkten (bijv. Fluo3/Fluo4) en genetisch gecodeerde Ca2±indicatoren (bv. GCaMP6) op zowel CLSM- als SD-systemen voor cellijnen die NET kunnen vormen. TIRF-microscopie geïntegreerd in SD is essentieel om de hechting en verspreiding van verschillende immuuncellen en processen in de buurt van het celoppervlak (bv. NET release) te controleren. Door gebruik te maken van CLSM- en SD-systemen, door gelijktijdig twee fluorescente signalen te detecteren, kunnen we de moleculaire effecten testen die het functioneren van immuuncellen (bv. interactie tussen receptoren, intracellulaire transportprocessen) in realtime, in de nabijheid van het celoppervlak en parallel met de meting van activering controleren. 2. Homologe recombinatie is een van de meest effectieve manieren om fouten in het DNA van organismen te corrigeren, kankertransformatie te voorkomen en nieuwe genvarianten te creëren. Naast de in vitro benadering testen we in hele organismen (worm en zebravis) DNA-HELICAS waarin subprocessen van celdeling, via welke moleculaire activiteiten en met welke eiwitpartners ze gecontroleerde recombinatie, nauwkeurige chromosomale segregatie bevorderen. Microscopen die gelijktijdige en snelle weergave van de twee fluorescerende signalen mogelijk maken, zijn essentieel voor het detecteren van processen in organismen die eiwitten produceren die betrokken zijn bij foutcorrectiemechanismen met verschillende fluorescerende etiketten. Analyse met CLSM- en SD-systemen vult daarom de uitgevoerde metingen aan met het reeds bestaande tweefotonenmicroscoopsysteem. 3. In de afgelopen jaren, door de ontwikkeling van moleculaire tattoo technologie, hebben we baanbrekende resultaten op het gebied van optofarmacologie bereikt. Met de ontwikkeling van licht-activeerbare farmaceutische derivaten hebben we de mogelijkheid om bepaalde celbiologische processen in het CLSM-systeem te reguleren door bepaalde micrometers te lokaliseren. De processen die de dynamische transformatie van de actin skeletten van zenuwcellen (bijv. groei en zoeken naar paden van axonen) regelen, kunnen wor... (Dutch)
5 September 2022
0 references
Θα θέλαμε να αποκτήσουμε δύο συμπληρωματικά μικροσκοπικά συστήματα για την εκτέλεση παρατηρήσεων σε ζωντανά κύτταρα, επιτρέποντας φυσιολογικές εξετάσεις. Το σύστημα σάρωσης με λέιζερ (CLSM) παρέχει εξαιρετικές ευκαιρίες για χειρισμούς και μετρήσεις φθορισμού (φωτοενεργοποίηση, φωτομετατροπή, φωτολεύκανση, μεταφορά ενέργειας συντονισμού Förster (FRET))· η ιδιαιτερότητα της εγγραφής σήματος αυξάνεται με φασματική ανίχνευση. Σε αυτό το σύστημα, μπορούμε να επικεντρώσουμε τις δοκιμές στις μικρότερες περιοχές μέσα στο οπτικό πεδίο, προαιρετικά καθορισμένες. Με το μικροσκοπικό σύστημα περιστρεφόμενων δίσκων (SD), μπορούμε να καταγράψουμε μοριακές διεργασίες σε ζωντανά κύτταρα ακόμα πιο γρήγορα από το σύστημα CLSM, ακόμη και με ρυθμό καταγραφής εικόνας χιλιοστό δευτερολέπτου, σε ολόκληρο το οπτικό πεδίο. Μια σημαντική πτυχή είναι ότι τα ζωντανά κύτταρα υπόκεινται σε λιγότερη έκθεση στο φως κατά τη διάρκεια των εγγραφών, έτσι ώστε να μπορούμε να συνεχίσουμε τις παρατηρήσεις για πολύ περισσότερο. Το προς προμήθεια σύστημα SD είναι επίσης κατάλληλο για την εμφάνιση μοριακών διεργασιών σε άμεση γειτνίαση με την επιφάνεια του κυττάρου (σε απόσταση 100-150 nm) με αυξημένη ανάλυση και υψηλή ταχύτητα σε σύγκριση με τις δοκιμές CLSM (TIRF, δηλαδή πλήρης εσωτερική μικροσκοπική ανάκλαση). Και τα δύο συστήματα είναι ικανά να καταγράφουν δύο σήματα φθορισμού ταυτόχρονα με 2 ανιχνευτές (CLSM) και 2 κάμερες (SDs), έτσι ώστε οι μοριακές αλληλεπιδράσεις, οι αλλαγές συγκέντρωσης και οι διαδικασίες μεταφοράς σε ζωντανά κύτταρα να παρακολουθούνται ειδικά σε πραγματικό χρόνο. Οι 14 ερευνητικές ομάδες που συμμετέχουν στην προσφορά διερευνούν τις μοριακές και κυτταρικές φυσιολογικές επιδράσεις των φλεγμονωδών και αυτοάνοσων ασθενειών που επηρεάζουν το σχηματισμό και τη μετάσταση όγκων, τις κυτταρικές διεργασίες της νευρικής πλαστικότητας και την αυτοπεπεψία των κυττάρων (βλ. επισυναπτόμενες βιογραφίες). Οι στόχοι είναι ευρείς, αλλά το κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι στοχεύουν στη διερεύνηση δυναμικών κυτταρικών βιολογικών αλλαγών στα ζωντανά κύτταρα. Τα προς προμήθεια μικροσκόπια παρέχουν τις απαραίτητες συνθήκες υποδομής για τις μελέτες και το εξαιρετικό επιστημονικό υπόβαθρο των συμμετεχόντων παρέχει την απαραίτητη πλατφόρμα γνώσεων για την εφαρμογή τους. Παρακάτω, οι μικροσκοπικές τεχνικές που θα χρησιμοποιηθούν παρουσιάζονται μέσα από μερικά κύρια θέματα. 1. Σε διάφορα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (π.χ. κοκκιοκύτταρα, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, λεμφοκύτταρα) διαδικασίες μετά τη σύνδεση των υποδοχέων, ο «διάλογος» μεταξύ των υποδοχέων παίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές ανοσολογικές διεργασίες. Για παράδειγμα, η συνεργασία μεταξύ των υποδοχέων συμπληρώματος και των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων για τα κοκκιοκύτταρα σημαντικά στη φλεγμονή, οδηγώντας στο σχηματισμό εξωκυτταρικών παγίδων ουδετερόφιλων (τα λεγόμενα NETs). Οι αλλαγές στο ενδοκυτταρικό σήμα Ca2+ που συνοδεύει την ενεργοποίηση ουδετερόφιλων μπορούν να ελεγχθούν με τη χρήση μελανιών δεικτών φθορισμού Ca (π.χ. Fluo3/Fluo4) και γενετικά κωδικοποιημένων δεικτών Ca2+ (π.χ. GCaMP6) τόσο σε συστήματα CLSM όσο και σε συστήματα SD για κυτταρικές σειρές ικανές να σχηματίσουν NET. Η μικροσκοπία TIRF που ενσωματώνεται στην SD είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση της προσκόλλησης και της εξάπλωσης διαφόρων ανοσοκυττάρων και διεργασιών κοντά στην επιφάνεια των κυττάρων (π.χ. απελευθέρωση NET). Με τη χρήση συστημάτων CLSM και SD, ανιχνεύοντας ταυτόχρονα δύο φθορίζοντα σήματα, μπορούμε να ελέγξουμε τις μοριακές επιδράσεις που ελέγχουν τη λειτουργία των ανοσοκυττάρων (π.χ. αλληλεπίδραση μεταξύ υποδοχέων, ενδοκυτταρικές διαδικασίες μεταφοράς) σε πραγματικό χρόνο, σε κοντινή απόσταση από την κυτταρική επιφάνεια και παράλληλα με τη μέτρηση της ενεργοποίησης. 2. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός είναι ένας από τους πιο αποτελεσματικούς τρόπους για τη διόρθωση σφαλμάτων στο DNA των οργανισμών, την πρόληψη του μετασχηματισμού του καρκίνου και τη δημιουργία νέων γονιδιακών παραλλαγών. Εκτός από την προσέγγιση in vitro, δοκιμάζουμε σε ολόκληρους οργανισμούς (σκώληκα και zebrafish) DNA-HELICAS όπου υπο-επεξεργασίες της κυτταρικής διαίρεσης, μέσω ποιες μοριακές δραστηριότητες και με ποιους πρωτεϊνικούς εταίρους προωθούν τον ελεγχόμενο ανασυνδυασμό, ακριβή χρωμοσωμικό διαχωρισμό. Τα μικροσκόπια που επιτρέπουν την ταυτόχρονη και ταχεία απεικόνιση των δύο σημάτων φθορισμού είναι απαραίτητα για την ανίχνευση διεργασιών σε οργανισμούς που παράγουν πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε μηχανισμούς διόρθωσης σφαλμάτων με διαφορετικές ετικέτες φθορισμού. Ως εκ τούτου, η ανάλυση με συστήματα CLSM και SD συμπληρώνει τις μετρήσεις που πραγματοποιούνται με το ήδη υπάρχον μικροσκοπικό σύστημα δύο φωτονίων. 3. Τα τελευταία χρόνια, αναπτύσσοντας τεχνολογία μοριακών τατουάζ, έχουμε επιτύχει πρωτοποριακά αποτελέσματα στον τομέα της οπτικοαρμακολογίας. Με την ανάπτυξη ελαφρών ενεργοποιήσιμων φαρμακευτικών παραγώγων, έχουμε την ευκαιρία να ρυθμίσουμε ορισμένες κυτταρικές βιολογικές διεργασίε... (Greek)
5 September 2022
0 references
Norime įsigyti dvi viena kitą papildančias mikroskopines sistemas gyvų ląstelių stebėjimams atlikti, leidžiančias atlikti fiziologinius tyrimus. Konferencinis lazerinis skenavimas (CLSM) suteikia puikias galimybes fluorescencinėms manipuliacijoms ir matavimams (fotoaktyvacija, fotokonversija, fotobalinimas, Förster rezonansinis energijos perdavimas (FRET)); signalo įrašymo specifiškumą padidina spektrinis aptikimas. Šioje sistemoje mes galime sutelkti bandymus į mažesnius regionus regėjimo lauke, pasirinktinai paskirtą. Su verpimo disku (SD) mikroskopine sistema molekulinius procesus gyvose ląstelėse galime įrašyti dar greičiau nei CLSM sistema, net milisekundžių vaizdo įrašymo greičiu, visame regėjimo lauke. Svarbus aspektas yra tas, kad gyvos ląstelės yra mažiau apšviestos įrašų metu, todėl mes galime tęsti stebėjimus daug ilgiau. Įsigytina SD sistema taip pat tinka molekuliniams procesams rodyti šalia ląstelės paviršiaus (100–150 nm atstumu) su didesne skiriamąja geba ir dideliu greičiu, palyginti su CLSM bandymais (TIRF, t. y. visiško vidinio atspindžio mikroskopija). Abi sistemos gali įrašyti du fluorescencinius signalus vienu metu su 2 detektoriais (CLSM) ir 2 kameromis (SD), kad molekulinės sąveikos, koncentracijos pokyčiai ir transportavimo procesai gyvose ląstelėse būtų specialiai stebimi realiu laiku. Konkurse dalyvavusios 14 mokslinių tyrimų grupių tiria uždegiminių ir autoimuninių ligų, turinčių įtakos navikų formavimuisi ir metastazei, ląstelių nervų plastiškumo procesams ir ląstelių virškinimui, molekulinį ir ląstelių fiziologinį poveikį (žr. pridedamas biografijas). Tikslai yra platūs, tačiau jų bendras bruožas yra tas, kad jais siekiama ištirti dinaminius ląstelių biologinius pokyčius gyvose ląstelėse. Mikroskopai, kuriuos reikia įsigyti, sudaro tyrimams būtinas infrastruktūros sąlygas, o išskirtiniai dalyvių moksliniai duomenys suteikia įgyvendinimui reikalingą žinių platformą. Toliau naudojami mikroskopiniai metodai pateikiami keliose pagrindinėse temose. 1. Įvairiose imuninėse ląstelėse (pvz., granulocituose, makrofaguose, dendritinėse ląstelėse, limfocituose) po ligando jungimosi su receptoriais „dialogas“ tarp receptorių atlieka lemiamą vaidmenį daugelyje fiziologinių ir patologinių imuninių procesų. Pavyzdžiui, bendradarbiavimas tarp komplemento receptorių ir granulocitų modelio atpažinimo receptorių, svarbių uždegimui, dėl kurio susidaro neutrofilų ekstraląsteliniai spąstai (vadinamieji NET). Ląstelėse esančių Ca2+ signalų pokyčius, susijusius su neutrofilų aktyvinimu, galima patikrinti naudojant fluorescencinius Ca-indikatoriaus rašalus (pvz., Fluo3/Fluo4) ir genetiškai užkoduotus Ca2+ rodiklius (pvz., GCaMP6) tiek CLSM, tiek SD sistemose, skirtose ląstelių linijoms, galinčioms formuoti NET. Į SD integruota TIRF mikroskopija yra labai svarbi stebint įvairių imuninių ląstelių ir procesų, esančių šalia ląstelių paviršiaus (pvz., NET atpalaidavimą), sukibimą ir plitimą. Naudodami CLSM ir SD sistemas, vienu metu aptikdami du fluorescencinius signalus, galime patikrinti molekulinį poveikį, kuris kontroliuoja imuninių ląstelių funkcionavimą (pvz., receptorių sąveiką, ląstelių transportavimo procesus) realiuoju laiku, arti ląstelių paviršiaus ir lygiagrečiai su aktyvinimo matavimu. 2. Homologinė rekombinacija yra vienas iš efektyviausių būdų ištaisyti klaidas organizmų DNR, užkirsti kelią vėžio transformacijai ir kurti naujus genų variantus. Be in vitro metodo, mes tiriame ištisus organizmus (kirminius ir zebražuves) DNR-HELICAS, kuriuose ląstelių dalijimosi subprocesai, per kuriuos molekulinė veikla ir su kuriais baltymų partneriai skatina kontroliuojamą rekombinaciją, tikslią chromosomų segregaciją. Mikroskopai, leidžiantys vienu metu ir greitai rodyti du fluorescencinius signalus, yra būtini siekiant aptikti procesus organizmuose, gaminančiuose baltymus, kurie dalyvauja klaidų koregavimo mechanizmuose su skirtingomis fluorescencinėmis etiketėmis. Todėl analizė su CLSM ir SD sistemomis papildo atliktus matavimus su jau esama dviejų fotonų mikroskopine sistema. 3. Pastaraisiais metais, kuriant molekulinės tatuiruotės technologiją, mes pasiekėme novatoriškų rezultatų optofarmakologijos srityje. Kurdami šviesos aktyvuojamus farmacijos darinius, turime galimybę reguliuoti tam tikrus ląstelių biologinius procesus CLSM sistemoje, lokalizuodami tam tikrus mikrometrus. Procesus, kurie kontroliuoja dinamišką nervų ląstelių aktino skeleto transformaciją (pvz., Aksonų augimą ir ieškojimą), galima ištirti esant didele erdvine ir laikina skiriamąja geba. MyosinII aksono augimas ir aktino dinamika (Lithuanian)
5 September 2022
0 references
Am dori să achiziționăm două sisteme microscopice complementare pentru a efectua observații asupra celulelor vii, permițând examinări fiziologice. Sistemul confocal de scanare laser (CLSM) oferă oportunități excelente pentru manipulări și măsurători fluorescente (fotoactivare, fotoconversie, fotoblelaj, transfer de energie prin rezonanță Förster (FRET)); specificitatea înregistrării semnalului este crescută prin detecție spectrală. În acest sistem, putem concentra testele pe regiunile mai mici din câmpul vizual, desemnate opțional. Cu sistemul microscopic al discului de filare (SD), putem înregistra procesele moleculare în celule vii chiar mai repede decât sistemul CLSM, chiar și la o rată de înregistrare a imaginilor de milisecundă, în întregul câmp vizual. Un aspect important este că celulele vii sunt supuse unei expuneri mai mici la lumină în timpul înregistrărilor, astfel încât să putem continua observațiile mult mai mult. Sistemul SD care urmează să fie achiziționat este, de asemenea, potrivit pentru afișarea proceselor moleculare în imediata vecinătate a suprafeței celulei (la o distanță de 100-150 nm) cu rezoluție crescută și viteză mare în comparație cu testele CLSM (TIRF, adică microscopia completă de reflexie internă). Ambele sisteme sunt capabile să înregistreze două semnale fluorescente simultan cu 2 detectoare (CLSM) și 2 camere (SD), astfel încât interacțiunile moleculare, schimbările de concentrație și procesele de transport în celulele vii sunt urmărite în mod specific în timp real. Cele 14 echipe de cercetare participante la licitație investighează efectele moleculare și fiziologice celulare ale bolilor inflamatorii și autoimune care afectează formarea tumorilor și metastazele, procesele celulare de plasticitate nervoasă și autodigestia celulelor (vezi biografiile atașate). Obiectivele sunt largi, dar caracteristica lor comună este că acestea urmăresc să exploreze schimbările biologice celulare dinamice în celulele vii. Microscoapele care urmează să fie achiziționate asigură condițiile de infrastructură necesare pentru studii, iar experiența științifică remarcabilă a participanților oferă platforma de cunoștințe necesară pentru implementare. Mai jos, tehnicile microscopice care urmează să fie utilizate sunt prezentate prin câteva teme principale. 1. În diferite celule imune (de exemplu, granulocite, macrofage, celule dendritice, limfocite) procesele care urmează legării ligand a receptorilor, „dialogul” dintre receptori joacă un rol crucial în multe procese imune fiziologice și patologice. De exemplu, cooperarea dintre receptorii complementului și receptorii de recunoaștere a modelelor pentru granulocite importante în inflamație, ducând la formarea capcanelor extracelulare neutrofile (așa-numitele NET). Modificările semnalului intracelular Ca2+ care însoțesc activarea neutrofilelor pot fi testate utilizând cerneluri fluorescente Ca-indicator (de exemplu, Fluo3/Fluo4) și indicatori Ca2+ codificați genetic (de exemplu, GCaMP6) pe sisteme CLSM și SD pentru liniile celulare capabile să formeze NET. Microscopia TIRF integrată în SD este esențială pentru monitorizarea aderenței și răspândirii diferitelor celule și procese imune în apropierea suprafeței celulare (de exemplu, eliberarea NET). Prin utilizarea sistemelor CLSM și SD, prin detectarea simultană a două semnale fluorescente, putem testa efectele moleculare care controlează funcționarea celulelor imune (de exemplu, interacțiunea dintre receptori, procesele de transport intracelular) în timp real, în imediata apropiere a suprafeței celulei și în paralel cu măsurarea activării. 2. Recombinarea omologă este una dintre cele mai eficiente modalități de a corecta erorile din ADN-ul organismelor, de a preveni transformarea cancerului și de a crea noi variante genetice. În plus față de abordarea in vitro, testăm în organisme întregi (vierme și pești-zebră) ADN-HELICAS în care sub-procesele de diviziune celulară, prin care activitățile moleculare și cu care parteneri proteici promovează recombinarea controlată, segregarea cromozomială precisă. Microscoapele care permit afișarea simultană și rapidă a celor două semnale fluorescente sunt esențiale pentru detectarea proceselor din organismele care produc proteine care sunt implicate în mecanismele de corecție a erorilor cu etichete fluorescente diferite. Prin urmare, analiza cu sistemele CLSM și SD completează măsurătorile efectuate cu sistemul microscopic cu doi fotoni deja existent. 3. În ultimii ani, prin dezvoltarea tehnologiei tatuajelor moleculare, am obținut rezultate revoluționare în domeniul optofarmacologiei. Odată cu dezvoltarea derivaților farmaceutici activi de lumină, avem posibilitatea de a regla anumite procese biologice celulare în sistemul CLSM prin localizarea anumitor micrometri. Procesele care controlează transformarea dinamică a scheletelor actinei ale celulelor nervoase (de exemplu, creșterea și căutarea căilor de axoni) pot fi explorate cu o rezoluție spațială și temporală r... (Romanian)
5 September 2022
0 references
Wir möchten zwei komplementäre mikroskopische Systeme erwerben, um Beobachtungen an lebenden Zellen durchzuführen, die physiologische Untersuchungen ermöglichen. Das konfokale Laserscanning-System (CLSM) bietet hervorragende Möglichkeiten für fluoreszierende Manipulationen und Messungen (Photoaktivierung, Photokonversion, Photobleaching, Förster-Resonant-Energietransfer (FRET)); die Spezifität der Signalaufnahme wird durch spektrale Detektion erhöht. In diesem System können wir die Tests auf die kleineren Regionen im Sichtfeld fokussieren, die optional ausgewiesen sind. Mit dem mikroskopischen System der Spinnscheibe (SD) können wir molekulare Prozesse in lebenden Zellen noch schneller erfassen als das CLSM-System, selbst mit einer Millisekunden-Bildaufnahmerate, im gesamten Sichtfeld. Ein wichtiger Aspekt ist, dass lebende Zellen während der Aufnahmen einer geringeren Lichtbelichtung ausgesetzt sind, so dass wir die Beobachtungen viel länger fortsetzen können. Das zu beschaffende SD-System eignet sich auch zur Darstellung molekularer Prozesse in unmittelbarer Nähe der Zelloberfläche (innerhalb eines Abstandes von 100-150 nm) mit erhöhter Auflösung und hoher Geschwindigkeit im Vergleich zu CLSM-Tests (TIRF, d. h. volle interne Reflexionsmikroskopie). Beide Systeme sind in der Lage, zwei fluoreszierende Signale gleichzeitig mit 2 Detektoren (CLSM) und 2 Kameras (SDs) aufzuzeichnen, so dass molekulare Wechselwirkungen, Konzentrationsänderungen und Transportprozesse in lebenden Zellen gezielt in Echtzeit verfolgt werden. Die 14 an der Ausschreibung beteiligten Forschungsteams untersuchen die molekular- und zellphysiologischen Wirkungen entzündlicher und autoimmuner Erkrankungen bei Tumorbildung und Metastasierung, zellulären Prozessen der nervösen Plastizität und der Selbstverdauung von Zellen (siehe beigefügte Biographien). Die Ziele sind breit, aber ihr gemeinsames Merkmal ist, dass sie darauf abzielen, dynamische zellbiologische Veränderungen in lebenden Zellen zu erforschen. Die zu beschaffenden Mikroskope bieten die notwendigen infrastrukturellen Bedingungen für die Studien, und der herausragende wissenschaftliche Hintergrund der Teilnehmer bietet die notwendige Wissensplattform für die Umsetzung. Im Folgenden werden die zu verwendenden mikroskopischen Techniken anhand einiger Hauptthemen vorgestellt. 1. In verschiedenen Immunzellen (z. B. Granulozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Lymphozyten) nach Ligandenbindung von Rezeptoren spielt der „Dialog“ zwischen Rezeptoren eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Immunprozessen. Zum Beispiel die Zusammenarbeit zwischen Komplementrezeptoren und Mustererkennungsrezeptoren für Granulozyten, die bei Entzündungen wichtig sind, was zur Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (sogenannten NETs) führt. Veränderungen im intrazellulären Ca2+ Signal begleitende Neutrophilenaktivierung können mit fluoreszierenden Ca-Indikatortinten (z. B. Fluo3/Fluo4) und genetisch kodierten Ca2±Indikatoren (z. B. GCaMP6) auf CLSM- und SD-Systemen für Zelllinien, die NET bilden können, getestet werden. Die in SD integrierte TIRF-Mikroskopie ist unerlässlich, um die Haftung und Ausbreitung verschiedener Immunzellen und Prozesse in der Nähe der Zelloberfläche (z. B. NET-Freisetzung) zu überwachen. Durch den Einsatz von CLSM- und SD-Systemen können wir durch die gleichzeitige Erkennung von zwei Fluoreszenzsignalen die molekularen Effekte testen, die die Funktion von Immunzellen (z. B. Interaktion zwischen Rezeptoren, intrazelluläre Transportprozesse) in Echtzeit, in unmittelbarer Nähe zur Zelloberfläche und parallel zur Messung der Aktivierung steuern. 2. Homologe Rekombination ist eine der effektivsten Möglichkeiten, Fehler in der DNA von Organismen zu korrigieren, Krebstransformation zu verhindern und neue Genvarianten zu schaffen. Neben dem In-vitro-Ansatz testen wir an ganzen Organismen (Wurm und Zebrafisch) DNA-HELICAS, in denen Unterprozesse der Zellteilung, durch welche molekularen Aktivitäten und mit welchen Proteinpartnern sie eine kontrollierte Rekombination, genaue Chromosomentrennung fördern. Mikroskope, die eine gleichzeitige und schnelle Anzeige der beiden fluoreszierenden Signale ermöglichen, sind essentiell für die Erkennung von Prozessen in Organismen, die Proteine produzieren, die an Fehlerkorrekturmechanismen mit unterschiedlichen Fluoreszenzetiketten beteiligt sind. Die Analyse mit CLSM- und SD-Systemen ergänzt daher die Messungen mit dem bereits vorhandenen mikroskopischen Zwei-Photonen-System. 3. In den letzten Jahren haben wir durch die Entwicklung der molekularen Tätowierungstechnologie bahnbrechende Ergebnisse im Bereich der Optoarmakologie erzielt. Mit der Entwicklung von lichtaktivierbaren pharmazeutischen Derivaten haben wir die Möglichkeit, bestimmte zellbiologische Prozesse im CLSM-System durch Lokalisierung bestimmter Mikrometer zu regulieren. Die Prozesse, die die dynamische Transformation der Aktinskelette von Ner... (German)
5 September 2022
0 references
Nos gustaría adquirir dos sistemas microscópicos complementarios para realizar observaciones sobre células vivas, permitiendo exámenes fisiológicos. El sistema de escaneo láser confocal (CLSM) ofrece excelentes oportunidades para manipulaciones y mediciones fluorescentes (fotoactivación, fotoconversión, fotoblanqueo, transferencia de energía resonante Förster (FRET)); la especificidad de la grabación de la señal se incrementa por la detección espectral. En este sistema, podemos enfocar las pruebas en las regiones más pequeñas dentro del campo de visión, opcionalmente designadas. Con el sistema microscópico de disco giratorio (SD), podemos registrar procesos moleculares en células vivas incluso más rápido que el sistema CLSM, incluso a una velocidad de grabación de imágenes de milisegundos, en todo el campo de visión. Un aspecto importante es que las células vivas están sujetas a menos exposición a la luz durante las grabaciones, por lo que podemos continuar las observaciones mucho más tiempo. El sistema SD a adquirir también es adecuado para mostrar procesos moleculares en las inmediaciones de la superficie celular (dentro de una distancia de 100-150 nm) con mayor resolución y alta velocidad en comparación con las pruebas CLSM (TIRF, es decir, microscopía de reflexión interna completa). Ambos sistemas son capaces de registrar dos señales fluorescentes simultáneamente con 2 detectores (CLSM) y 2 cámaras (SD), de modo que las interacciones moleculares, los cambios de concentración y los procesos de transporte en células vivas se rastrean específicamente en tiempo real. Los 14 equipos de investigación que participan en la licitación están investigando los efectos fisiológicos moleculares y celulares de enfermedades inflamatorias y autoinmunes que afectan la formación de tumores y metástasis, los procesos celulares de plasticidad nerviosa y la autodigestión de las células (ver biografías adjuntas). Los objetivos son amplios, pero su característica común es que su objetivo es explorar los cambios biológicos celulares dinámicos en las células vivas. Los microscopios a adquirir proporcionan las condiciones de infraestructura necesarias para los estudios, y los antecedentes científicos sobresalientes de los participantes proporcionan la plataforma de conocimiento necesaria para la implementación. A continuación, las técnicas microscópicas que se utilizarán se presentan a través de algunos temas principales. 1. En varias células inmunes (por ejemplo, granulocitos, macrófagos, células dendríticas, linfocitos) procesos después de ligando los receptores, el «diálogo» entre receptores juega un papel crucial en muchos procesos inmunológicos fisiológicos y patológicos. Por ejemplo, la cooperación entre los receptores complementarios y los receptores de reconocimiento de patrones para granulocitos importantes en la inflamación, lo que lleva a la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (los llamados NET). Los cambios en la señal intracelular Ca2+ que acompaña a la activación de neutrófilos pueden probarse utilizando tintas fluorescentes Ca-indicadores (por ejemplo, Fluo3/Fluo4) y indicadores Ca2+ codificados genéticamente (por ejemplo, GCaMP6) en sistemas CLSM y SD para líneas celulares capaces de formar NET. La microscopía TIRF integrada en SD es esencial para monitorear la adhesión y propagación de varias células inmunes y procesos cerca de la superficie celular (por ejemplo, liberación de NET). Mediante el uso de sistemas CLSM y SD, mediante la detección simultánea de dos señales fluorescentes, podemos probar los efectos moleculares que controlan el funcionamiento de las células inmunes (por ejemplo, interacción entre receptores, procesos de transporte intracelular) en tiempo real, en estrecha proximidad a la superficie celular y en paralelo con la medición de la activación. 2. La recombinación homóloga es una de las formas más efectivas de corregir errores en el ADN de los organismos, prevenir la transformación del cáncer y crear nuevas variantes genéticas. Además del enfoque in vitro, probamos en organismos enteros (gusano y pez cebra) ADN-HELICAS en los que subprocesos de división celular, a través de los cuales las actividades moleculares y con los que los socios proteicos promueven la recombinación controlada, la segregación cromosómica precisa. Los microscopios que permiten la visualización simultánea y rápida de las dos señales fluorescentes son esenciales para detectar procesos en organismos productores de proteínas que intervienen en mecanismos de corrección de errores con diferentes etiquetas fluorescentes. Por lo tanto, el análisis con sistemas CLSM y SD complementa las mediciones realizadas con el sistema microscópico de dos fotones ya existente. 3. En los últimos años, mediante el desarrollo de la tecnología del tatuaje molecular, hemos logrado resultados innovadores en el campo de la optofarmacología. Con el desarrollo de derivados farmacéuticos activados por luz, tenemos la oportunidad de reg... (Spanish)
5 September 2022
0 references
Mēs vēlamies iegādāties divas savstarpēji papildinošas mikroskopiskas sistēmas, lai veiktu novērojumus par dzīvajām šūnām, ļaujot veikt fizioloģiskos izmeklējumus. Konfokālās lāzerskenēšanas (CLSM) sistēma nodrošina lieliskas iespējas fluorescējošām manipulācijām un mērījumiem (fotoaktivācija, fotokonversija, fotobalināšana, Förster rezonanses enerģijas pārnese (FRET)); signāla ierakstīšanas specifiskumu palielina spektrālā noteikšana. Šajā sistēmā mēs varam koncentrēt testus uz mazākiem reģioniem redzamības laukā, kas pēc izvēles ir noteikts. Ar vērpšanas disku (SD) mikroskopisko sistēmu mēs varam ierakstīt molekulāros procesus dzīvajās šūnās vēl ātrāk nekā CLSM sistēma, pat ar milisekundes attēlu ierakstīšanas ātrumu visā redzes laukā. Svarīgs aspekts ir tas, ka dzīvās šūnas ierakstu laikā tiek pakļautas mazākai gaismas iedarbībai, tāpēc mēs varam turpināt novērojumus daudz ilgāk. Iepērkamā SD sistēma ir piemērota arī molekulāro procesu attēlošanai šūnas virsmas tiešā tuvumā (100–150 nm attālumā) ar lielāku izšķirtspēju un lielu ātrumu salīdzinājumā ar CLSM testiem (TIRF, t. i., pilnas iekšējās atstarošanas mikroskopija). Abas sistēmas spēj ierakstīt divus fluorescējošus signālus vienlaicīgi ar 2 detektoriem (CLSM) un 2 kamerām (SD), lai molekulārā mijiedarbība, koncentrācijas izmaiņas un transportēšanas procesi dzīvajās šūnās tiktu konkrēti izsekoti reāllaikā. 14 pētījuma komandas, kas piedalās konkursā, pēta iekaisuma un autoimūno slimību molekulāro un šūnu fizioloģisko ietekmi, kas ietekmē audzēju veidošanos un metastāzi, nervu plastiskus šūnu procesus un šūnu pašgremošanu (skatīt pievienotās biogrāfijas). Mērķi ir plaši, bet to kopīgā iezīme ir tā, ka to mērķis ir izpētīt dinamiskas šūnu bioloģiskās izmaiņas dzīvajās šūnās. Iepērkamie mikroskopi nodrošina pētījumiem nepieciešamos infrastruktūras apstākļus, un dalībnieku izcilā zinātniskā pieredze nodrošina īstenošanai nepieciešamo zināšanu platformu. Zemāk izmantotās mikroskopiskās metodes ir aprakstītas, izmantojot dažas galvenās tēmas. 1. Dažādu imūnšūnu (piemēram, granulocītu, makrofāgu, dendritisko šūnu, limfocītu) procesos pēc receptoru ligandas saistīšanās “dialogam” starp receptoriem ir izšķiroša nozīme daudzos fizioloģiskos un patoloģiskos imūnprocesos. Piemēram, sadarbība starp komplementa receptoriem un iekaisuma procesā nozīmīgu granulocītu rakstu atpazīšanas receptoriem, kas izraisa neitrofilu ekstracelulāro slazdu (tā saukto NET) veidošanos. Izmaiņas intracelulārā Ca2+ signālā, kas pievienots neitrofilu aktivācijai, var pārbaudīt, izmantojot fluorescējošas Ca indikatora tintes (piemēram, Fluo3/Fluo4) un ģenētiski kodētus Ca2+ indikatorus (piemēram, GCaMP6) gan CLSM, gan SD sistēmās šūnu līnijām, kas spēj veidot NET. TIRF mikroskopija, kas integrēta SD, ir būtiska, lai uzraudzītu dažādu imūnšūnu un procesu saķeri un izplatīšanos šūnu virsmas tuvumā (piemēram, NET izdalīšanās). Izmantojot CLSM un SD sistēmas, vienlaikus nosakot divus fluorescējošus signālus, mēs varam pārbaudīt molekulāros efektus, kas kontrolē imūnšūnu darbību (piemēram, mijiedarbību starp receptoriem, intracelulāros transportēšanas procesus) reāllaikā, tuvu šūnas virsmai un paralēli aktivizācijas mērījumiem. 2. Homologā rekombinācija ir viens no efektīvākajiem veidiem, kā labot kļūdas organismu DNS, novērst vēža transformāciju un radīt jaunus gēnu variantus. Papildus in vitro pieejai mēs testējam veselus organismus (tārpus un zebras zivs) DNS-HELICAS, kuros šūnu dalīšanas apakšprocesi, caur kuriem molekulārā aktivitāte un ar kuriem olbaltumvielu partneri veicina kontrolētu rekombināciju, precīzu hromosomu segregāciju. Mikroskopi, kas ļauj vienlaicīgi un ātri parādīt abus fluorescējošos signālus, ir būtiski, lai noteiktu procesus organismos, kuri ražo olbaltumvielas, kas ir iesaistīti kļūdu korekcijas mehānismos ar dažādām fluorescējošām etiķetēm. Tāpēc analīze ar CLSM un SD sistēmām papildina veiktos mērījumus ar jau esošo divu fotonu mikroskopisko sistēmu. 3. Pēdējos gados, attīstot molekulāro tetovējumu tehnoloģiju, mēs esam sasnieguši revolucionārus rezultātus optofarmakoloģijas jomā. Attīstoties viegli aktivējamiem farmaceitiskajiem atvasinājumiem, mums ir iespēja regulēt noteiktus šūnu bioloģiskos procesus CLSM sistēmā, lokalizējot noteiktus mikrometrus. Procesus, kas kontrolē nervu šūnu aktinu skeletu dinamisko transformāciju (piemēram, augšanu un aksonu ceļu meklēšanu), var izpētīt ar augstu telpisko un laika izšķirtspēju. MyosinII axon augšanas un aktindinamikas plūsma (Latvian)
5 September 2022
0 references
Budapest, Budapest
0 references
Identifiers
VEKOP-2.3.3-15-2016-00007
0 references