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PREVIAMENTE DESCRIBIMOS LOS POTENCIADORES CAPACITADOS (¿POISED ENHANCERS¿ (PES) EN INGLES) COMO UN CONJUNTO DE SECUENCIAS REGULADORAS PRESENTES EN CELULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS (ESC) Y CON CARACTERISTICAS UNICAS EN SU CROMATINA, QUE INCLUYEN LA UNION DEL COACTIVADOR P300 Y DE PROTEINAS POLYCOMB (PCG). ORIGINALMENTE PROPUSIMOS QUE ESTAS PROPIEDADES CROMATINICAS PODRIAN FACILITAR LA FUTURA ACTIVACION DE LOS PES DURANTE LA DIFERENCIACION DE LAS ESC. MAS RECIENTEMENTE, Y UTILIZANDO ESC DE RATON (MESC), DEMOSTRAMOS QUE LOS PES SON NECESARIOS PARA LA INDUCCION DE IMPORTANTES GENES ANTERO-NEURALES. CURIOSAMENTE, OBSERVAMOS QUE LOS PES ESTABLECEN INTERACCIONES FISICAS CON SUS GENES DIANA EN ESC EN UNA FORMA DEPENDIENTE DEL COMPLEJO POLYCOMB PRC2. ADEMAS, TAMBIEN DEMOSTRAMOS QUE LA PERDIDA DE PRC2 NO CONDUCE A LA ACTIVACION DE LOS PES NI A LA INDUCCION DE SUS GENES DIANA EN ESC. POR EL CONTRARIO, LA PERDIDA DE PRC2 AFECTA GRAVE Y ESPECIFICAMENTE LA INDUCCION DE GENES NEURONALES ANTERIORES REGULADOS POR LOS PES. POR LO TANTO, NUESTRO RECIENTE TRABAJO RESULTO EN LA DESCRIPCION DE UNA NOVEDOSA FUNCION PARA LAS PROTEINAS PCG, QUE PROPUSIMOS PODRIAN FACILITAR LA INDUCCION NEURAL AL PROPORCIONAR A CIERTOS GENES ANTERO-NEURALES CON UNA TOPOLOGIA REGULADORA PERMISIVA._x000D_ _x000D_ AUNQUE NUESTRO RECIENTE TRABAJO HA PROPORCIONADO IMPORTANTES DETALLES ACERCA DE LA RELEVANCIA FUNCIONAL Y EL MECANISMO DE ACCION DE LOS PE, ACTUALMENTE NO SE SABE POR QUE Y COMO LA ACTIVIDAD REGULADORA DE LOS PE SE DIRIGE ESPECIFICAMENTE HACIA CIERTOS GENES NEURALES ANTERIORES. PARA ABORDAR ESTO, PRIMERO EVALUAREMOS DE FORMA GLOBAL COMO PCG Y CIERTAS PROTEINAS CON FUNCIONES ESTRUCTURALES CONTROLAN LA ORGANIZACION TRIDIMENSIONAL DE LOS PES EN MESC. NUESTRA HIPOTESIS ES QUE MIENTRAS QUE LAS PROTEINAS PCG PODRIAN MEDIAR DIRECTAMENTE LA COMUNICACION FISICA ENTRE PE Y SUS GENES DIANA, LAS PROTEINAS ESTRUCTURALES COMO CTCF Y COHESIN PODRIAN RESTRINGIR TALES INTERACCIONES Y LIMITAR A LOS PE A CONTACTAR Y REGULAR GENES LOCALIZADOS EN EL MISMO DOMINIO DE ASOCIACION TOPOLOGICA (TAD). POR OTRO LADO, MUCHOS DE LOS ENFOQUES EXPERIMENTALES USADOS PARA ELUCIDAR EL MECANISMO DE ACCION DE LOS POTENCIADORES SE BASAN EN LA PERDIDA COMPLETA DE PROTEINAS QUE UNEN DICHAS SECUENCIAS POTENCIADORAS. SIN EMBARGO, ESTOS ENFOQUES PUEDEN PROVOCAR CAMBIOS TRANSCRIPCIONALES Y EN LA ARQUITECTURA 3D DEL GENOMA QUE PODRIAN ALTERAR LA FUNCION DE LOS POTENCIADORES DE UNA MANERA INDIRECTA. AQUI PROPONEMOS SOLVENTAR ESTAS LIMITACIONES MEDIANTE LA INGENIERIA SINTETICA DE PES EN MESC PARA EVALUAR DE FORMA RIGUROSA Y MECANISTICA LAS PROPIEDADES REGULATORIAS, EPIGENETICAS Y TOPOLOGICAS DE LOS PES. ESTA ESTRATEGIA EXPERIMENTAL NOS PERMITIRA DISECCIONAR GENETICAMENTE LOS PES, QUE CREEMOS PUEDEN TENER UNA COMPOSICION MODULAR CONSISTENTE EN UN GRUPO DE SITIOS DE UNION PARA FACTORES DE TRANSCRIPCION (TFBS) Y UNA ISLA CPG (CGI). EL TFBS PODRIA CONFERIR A LOS PES SU CAPACIDAD DE ACTIVACION GENICA EN CIS, MIENTRAS QUE LA CGI PODRIA DOTAR A LOS PES DE UNA CROMATINA Y UN ENTORNO TOPOLOGICO APROPIADO QUE FACILITE LA ACTIVACION FUTURA DE LOS GENES DIANA DE LOS PES._x000D_ _x000D_ EN GENERAL, EL TRABAJO PROPUESTO PROPORCIONARA IMPORTANTES CONOCIMIENTOS SOBRE LA LOGICA REGULADORA DE LOS PES Y EL PAPEL DE LAS PROTEINAS PCG COMO FACILITADORES TOPOLOGICOS DE LA INDUCCION GENICA. ADEMAS, NUESTRO TRABAJO DEBERIA ESCLARECER ALGUNAS DE LAS REGLAS REGULADORAS AUN POCO CONOCIDAS QUE RIGEN DE FORMA GENERAL LA COMUNICACION ENTRE POTENCIADORES Y GENES. (Spanish)

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WE PREVIOUSLY IDENTIFIED POISED ENHANCERS (PES) IN HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS (ESC) AS A LIMITED SET OF CIS-REGULATORY SEQUENCES DISPLAYING A UNIQUE CHROMATIN SIGNATURE, WHICH INCLUDES BINDING BY THE CO-ACTIVATOR P300 AND POLYCOMB-GROUP (PCG) PROTEINS. WE ORIGINALLY PROPOSED THAT THIS CHROMATIN SIGNATURE COULD BOOKMARK PES IN PLURIPOTENT CELLS TO FACILITATE THEIR TIMELY ACTIVATION UPON ESC DIFFERENTIATION. MOST RECENTLY AND USING MOUSE ESC (MESC) AS A GENETICALLY TRACTABLE MODEL, WE DEMONSTRATED THAT PES ARE NECESSARY FOR THE INDUCTION OF MAJOR ANTERIOR NEURAL REGULATORS. INTERESTINGLY, PES ALREADY ESTABLISHED PHYSICAL INTERACTIONS WITH THEIR TARGET GENES IN ESC IN A POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2 (PRC2) DEPENDENT MANNER. LOSS OF PRC2 LED TO NEITHER THE ACTIVATION OF PES NOR THE INDUCTION OF THEIR TARGET GENES IN UNDIFFERENTIATED ESC. IN CONTRAST, LOSS OF PRC2 SEVERELY AND SPECIFICALLY COMPROMISED THE INDUCTION OF MAJOR ANTERIOR NEURAL GENES REPRESENTING PE TARGETS. HENCE, OUR RECENT WORK ILLUMINATED A NOVEL AND UNEXPECTED FUNCTION FOR PCG PROTEINS, WHICH WE PROPOSED COULD FACILITATE NEURAL INDUCTION BY PROVIDING MAJOR ANTERIOR NEURAL LOCI WITH A PERMISSIVE REGULATORY TOPOLOGY._x000D_ _x000D_ ALTHOUGH OUR RECENT WORK HAS PROVIDED MAJOR INSIGHTS INTO THE FUNCTIONAL RELEVANCE AND MECHANISM OF ACTION OF PLURIPOTENCY-ASSOCIATED PES, IT IS CURRENTLY UNKNOWN WHY AND HOW PE REGULATORY ACTIVITY IS SPECIFICALLY DIRECTED TOWARDS MAJOR ANTERIOR NEURAL GENES. TO ADDRESS THIS, WE WILL FIRST USE FUNCTIONAL GENOMIC AND CONDITIONAL KNOCK-DOWN APPROACHES TO GLOBALLY ASSESS HOW PCG AND ARCHITECTURAL PROTEINS CONTROL THE 3D ORGANIZATION OF PE LOCI IN MESC. WE HYPOTHESIZE THAT WHILE PCG PROTEINS MIGHT DIRECTLY MEDIATE THE PHYSICAL COMMUNICATION BETWEEN PES AND THEIR TARGET GENES, ARCHITECTURAL PROTEINS, SUCH AS CTCF AND COHESIN, MIGHT CONSTRAIN SUCH INTERACTIONS AND LIMIT PES TO SPECIFICALLY CONTACT AND REGULATE PCG-BOUND GENES LOCATED WITHIN THE SAME TOPOLOGICALLY ASSOCIATING DOMAIN (TAD). ON THE OTHER HAND, MANY OF THE EXPERIMENTAL APPROACHES TYPICALLY USED TO ELUCIDATE THE MECHANISM OF ACTION OF ENHANCERS ARE BASED ON THE COMPLETE LOSS OF ENHANCER-BOUND PROTEINS. HOWEVER, SUCH LOSS-OF-FUNCTION APPROACHES CAN ELICIT TRANSCRIPTIONAL AND/OR 3D GENOME ARCHITECTURAL CHANGES THAT CAN POTENTIALLY ALTER ENHANCER FUNCTION IN AN INDIRECT MANNER. HERE WE PROPOSE TO OVERCOME THESE LIMITATIONS BY SYNTHETICALLY ENGINEERING PES IN MESC IN ORDER TO RIGOROUSLY AND MECHANISTICALLY ASSESS THE REGULATORY, EPIGENETIC AND TOPOLOGICAL FEATURES OF PE LOCI. THIS EXPERIMENTAL STRATEGY WILL ALLOW US TO GENETICALLY DISSECT PES, WHICH WE HYPOTHESIZE DISPLAY A MODULAR COMPOSITION CONSISTING OF A CLUSTER OF HIGHLY CONSERVED TRANSCRIPTION FACTOR BINDING SITES (TFBS) AND A NEARBY CPG ISLAND (CGI). THE TFBS MIGHT CONFER PES THEIR FUNDAMENTAL CIS-ACTIVATION CAPACITY UPON ESC DIFFERENTIATION, WHILE THE CGI MIGHT ENDOW PES WITH A PERMISSIVE CHROMATIN AND TOPOLOGICAL ENVIRONMENT THAT FACILITATES THE FUTURE ACTIVATION OF THE PE TARGET GENES. _x000D_ _x000D_ OVERALL, THE PROPOSED WORK WILL PROVIDE MAJOR INSIGHTS INTO THE REGULATORY LOGIC OF PES AND THE ROLE OF PCG PROTEINS AS TOPOLOGICAL FACILITATORS OF FUTURE GENE INDUCTION. FURTHERMORE, OUR WORK SHOULD ILLUMINATE SOME OF THE GENERAL, YET POORLY CHARACTERIZED, REGULATORY RULES GOVERNING THE SPECIFICITY AND COMPATIBILITY OF ENHANCER-GENE COMMUNICATION. (English)

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Santander

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PGC2018-095301-B-I00

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