Functional analysis in vitro and in a zebrafish model of candidate genes in primary congenital glaucoma. Identification of new genes by mass sequencing of exomas. (Q3143457)
Jump to navigation
Jump to search
Project Q3143457 in Spain
| Language | Label | Description | Also known as |
|---|---|---|---|
| English | Functional analysis in vitro and in a zebrafish model of candidate genes in primary congenital glaucoma. Identification of new genes by mass sequencing of exomas. |
Project Q3143457 in Spain |
Statements
84,185.2 Euro
0 references
104,500.0 Euro
0 references
80.56 percent
0 references
1 January 2016
0 references
31 March 2020
0 references
UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA
0 references
OBJETIVOS PRINCIPALES: 1) Analizar funcionalmente las mutaciones de los genes candidato GPATCH3, LRP2 y GUCA1C, identificadas previamente por nuestro grupo en el estudio del exoma de 26 pacientes con glaucoma congénito primario grave. 2) Estudiar en larvas de pez cebra los fenotipos oculares resultantes de reducir o incrementar la expresión de los genes ortólogos de los 3 genes mencionados anteriormente. 3) Analizar la presencia de mutaciones de los genes candidato LRP2 y GUCA1C en 90 pacientes con glaucoma congénito sin mutaciones conocidas. 4) Identificar nuevos genes implicados en la enfermedad mediante reanálisis de 23 de los exomas ya secuenciados, siguiendo una estrategia de análisis de tríos formados por el probando y sus progenitores sanos. METODOLOGÍA: Objetivo 1) Las mutaciones identificadas se generarán mediante mutagénesis dirigida. Posteriormente serán expresadas en células HEK-293T y se analizará su estabilidad, localización subcelular y transactivación, mediante western blot, inmunocitoquímica y ensayos con luciferasa, respectivamente. Objetivo 2) Se estudiará en larvas de pez cebra la expresión de los genes ortólogos de los 3 genes candidato, utilizando hibridación in situ fluorescente y microscopía confocal. También se analizará mediante microscopía confocal el fenotipo ocular después de inhibir la expresión de estos genes ortólogos (knockdown con morfolinos) y de sobreexpresarlos transitoriamente (microinyección de ARNm). Objetivo 3) El rastreo en 90 pacientes de mutaciones de los genes LRP2 y GUCA1C se realizará mediante secuenciación masiva (targeted sequencing). Objetivo 4) Para el estudio de los 23 exomas en tríos se determinará la secuencia del exoma de los progenitores mediante secuenciación masiva. Se aplicarán distintos filtros para identificar las variantes candidatas y se realizarán estudios funcionales para confirmar su patogenicidad. (Spanish)
0 references
MAIN OBJECTIVES: 1) Functionally analyse the mutations of the candidate genes GPATCH3, LRP2 and GUCA1C, previously identified by our group in the exome study of 26 patients with severe primary congenital glaucoma. 2) Study in zebrafish larvae the ocular phenotypes resulting from reducing or increasing the expression of orthologist genes of the 3 genes mentioned above. 3) Analyse the presence of mutations of candidate LRP2 and GUCA1C genes in 90 patients with congenital glaucoma without known mutations. 4) Identify new genes involved in the disease by reanalysis of 23 of the exomas already sequenced, following a threesome analysis strategy formed by the tester and his healthy parents. METHODOLOGY: Objective 1) The mutations identified will be generated by targeted mutagenesis. Subsequently, they shall be expressed in HEK-293T cells and their stability, subcellular location and transactivation shall be analysed using western blot, immunocytochemistry and luciferase assays, respectively. Objective 2) The expression of orthologist genes of the 3 candidate genes will be studied in zebrafish larvae, using fluorescent in situ hybridisation and confocal microscopy. The ocular phenotype will also be analysed by confocal microscopy after inhibiting the expression of these ortologist genes (knockdown with morfolins) and transiently overexpressing them (mRNA microinjection). Objective 3) The tracing in 90 patients of mutations of the LRP2 and GUCA1C genes will be carried out by mass sequencing (targeted sequencing). Objective 4) For the study of the 23 exomas in threesomes, the parent exome sequence will be determined by mass sequencing. Different filters will be applied to identify the candidate variants and functional studies will be carried out to confirm their pathogenicity. (English)
12 October 2021
0.1106471356308225
0 references
PRINCIPAUX OBJECTIFS: 1) Analyser fonctionnellement les mutations des gènes candidats GPATCH3, LRP2 et GUCA1C, précédemment identifiées par notre groupe dans l’étude exome de 26 patients atteints de glaucome congénital primaire sévère. 2) Étude chez les larves de poissons zèbres des phénotypes oculaires résultant de la réduction ou de l’augmentation de l’expression des gènes orthologistes des 3 gènes mentionnés ci-dessus. 3) Analyser la présence de mutations des gènes candidats LRP2 et GUCA1C chez 90 patients atteints de glaucome congénital sans mutations connues. 4) Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie par une réanalyse de 23 des exomes déjà séquencés, à la suite d’une stratégie d’analyse à trois formées par le testeur et ses parents en bonne santé. MÉTHODOLOGIE: Objectif 1) Les mutations identifiées seront générées par la mutagénèse ciblée. Par la suite, ils doivent être exprimés en cellules HEK-293T et leur stabilité, leur emplacement sous-cellulaire et leur transactivation doivent être analysés à l’aide d’essais de blot occidental, d’immunocytochimie et de luciférase, respectivement. Objectif 2) L’expression des gènes orthologistes des 3 gènes candidats sera étudiée chez les larves de poissons zèbres, en utilisant l’hybridation fluorescente in situ et la microscopie confocale. Le phénotype oculaire sera également analysé par microscopie confocale après avoir inhibé l’expression de ces gènes ortologues (knockdown with morfolins) et les surexprimer de façon transitoire (microinjection d’ARNm). Objectif 3) Le traçage des mutations des gènes LRP2 et GUCA1C chez 90 patients sera effectué par séquençage de masse (séquençage ciblé). Objectif 4) Pour l’étude des 23 exomas dans les trios, la séquence d’exome parent sera déterminée par séquençage de masse. Différents filtres seront appliqués pour identifier les variantes candidates et des études fonctionnelles seront effectuées pour confirmer leur pathogénicité. (French)
2 December 2021
0 references
HAUPTZIELE: 1) Funktionell analysieren Sie die Mutationen der Kandidatengene GPATCH3, LRP2 und GUCA1C, die zuvor von unserer Gruppe in der Exome-Studie von 26 Patienten mit schwerem primärem angeborenem Glaukom identifiziert wurden. 2) Studie an Zebrafischlarven die Augenphänotypen, die sich aus der Verringerung oder Erhöhung der Expression von orthologen Genen der oben genannten 3 Gene ergeben. 3) Analysieren Sie das Vorhandensein von Mutationen von Kandidaten-LRP2- und GUCA1C-Genen bei 90 Patienten mit angeborenem Glaukom ohne bekannte Mutationen. 4) Identifizieren Sie neue Gene, die an der Krankheit beteiligt sind, durch Neuanalyse von 23 der bereits sequenzierten Exomen nach einer dreifachen Analysestrategie, die vom Tester und seinen gesunden Eltern gebildet wurde. METHODIK: Ziel 1) Die identifizierten Mutationen werden durch gezielte Mutagenese erzeugt. Anschließend sind sie in HEK-293T-Zellen auszudrücken, und ihre Stabilität, ihre subzelluläre Lage und ihre Transaktivierung sind anhand von Western Blot-, Immunzytochemie- und Luciferase-Assays zu analysieren. Ziel 2) Die Expression von orthologen Genen der 3 Kandidatengene wird in Zebrafischlarven unter Verwendung von Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und konfokaler Mikroskopie untersucht. Der okuläre Phänotyp wird auch durch konfokale Mikroskopie analysiert, nachdem die Expression dieser Ortologengene (Knockdown mit Morfolinen) hemmt und vorübergehend überexprimiert wird (mRNA-Mikroinjektion). Ziel 3) Die Rückverfolgung von Mutationen der LRP2- und GUCA1C-Gene bei 90 Patienten erfolgt durch Massensequenzierung (gezielte Sequenzierung). Ziel 4) Für die Untersuchung der 23 Exomen in Dreier wird die Elternexome-Sequenz durch Massensequenzierung bestimmt. Es werden verschiedene Filter verwendet, um die Kandidatenvarianten zu identifizieren, und es werden funktionelle Studien durchgeführt, um deren Pathogenität zu bestätigen. (German)
9 December 2021
0 references
BELANGRIJKSTE DOELSTELLINGEN: 1) Functioneel analyseren van de mutaties van de kandidaat-genen GPATCH3, LRP2 en GUCA1C, eerder geïdentificeerd door onze groep in de exome studie van 26 patiënten met ernstige primaire aangeboren glaucoom. 2) Studie bij zebravislarven de oculaire fenotypen die het gevolg zijn van het verminderen of verhogen van de expressie van ortholooggenen van de drie hierboven genoemde genen. 3) Analyseer de aanwezigheid van mutaties van kandidaat LRP2 en GUCA1C genen bij 90 patiënten met aangeboren glaucoom zonder bekende mutaties. 4) Identificeer nieuwe genen die betrokken zijn bij de ziekte door heranalyse van 23 van de reeds gesequificeerde exoma’s, na een drietal analysestrategie gevormd door de tester en zijn gezonde ouders. METHODOLOGIE: Doelstelling 1) De geïdentificeerde mutaties zullen worden gegenereerd door gerichte mutagenese. Vervolgens worden ze uitgedrukt in HEK-293T-cellen en de stabiliteit, subcellulaire locatie en transactivatie ervan worden geanalyseerd aan de hand van westerse vlek-, immunocytochemie- en luciferasetests. Doelstelling 2) De expressie van ortholoog genen van de 3 kandidaat genen zal worden bestudeerd in zebravislarven, met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie en confocale microscopie. Het oculaire fenotype zal ook worden geanalyseerd door confocale microscopie na het remmen van de expressie van deze ortologengenen (klopdown met morfolinen) en voorbijgaand overexpressie (mRNA micro-injectie). Doelstelling 3) De tracering bij 90 patiënten van mutaties van de LRP2- en GUCA1C-genen zal worden uitgevoerd door massasequencing (gerichte sequencing). Doelstelling 4) Voor de studie van de 23 exoma’s in trisomen, zal de ouder exome sequentie worden bepaald door massa sequencing. Er zullen verschillende filters worden toegepast om de kandidaat-varianten te identificeren en er zullen functionele studies worden uitgevoerd om hun pathogeniteit te bevestigen. (Dutch)
17 December 2021
0 references
OBIETTIVI PRINCIPALI: 1) Analizzi funzionalmente le mutazioni dei geni candidati GPATCH3, LRP2 e GUCA1C, precedentemente identificati dal nostro gruppo nello studio exome di 26 pazienti con glaucoma congenito primario grave. 2) Studiare nelle larve di pesce zebra i fenotipi oculari derivanti dalla riduzione o dall'aumento dell'espressione dei geni ortologici dei 3 geni di cui sopra. 3) Analizzare la presenza di mutazioni dei geni candidati LRP2 e GUCA1C in 90 pazienti con glaucoma congenito senza mutazioni note. 4) Identificare i nuovi geni coinvolti nella malattia mediante rianalisi di 23 degli esomi già sequenziati, seguendo una strategia di analisi a tre formata dal tester e dai suoi genitori sani. METODOLOGIA: Obiettivo 1) Le mutazioni individuate saranno generate da mutagenesi mirata. Successivamente, essi devono essere espressi in cellule HEK-293T e la loro stabilità, posizione subcellulare e transattivazione devono essere analizzate utilizzando, rispettivamente, test western blot, immunocitochimica e luciferasi. Obiettivo 2) L'espressione dei geni ortologi dei 3 geni candidati sarà studiata nelle larve di zebrafish, utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ e la microscopia confocale. Il fenotipo oculare sarà analizzato anche mediante microscopia confocale dopo aver inibito l'espressione di questi geni ortologici (knockdown con morfoline) e sopraesprimendoli transitoriamente (microiniezione mRNA). Obiettivo 3) Il tracciamento in 90 pazienti di mutazioni dei geni LRP2 e GUCA1C sarà effettuato mediante sequenziamento di massa (sequenziamento mirato). Obiettivo 4) Per lo studio dei 23 esomi in trio, la sequenza di esomo genitore sarà determinata dal sequenziamento di massa. Saranno applicati diversi filtri per identificare le varianti candidate e saranno effettuati studi funzionali per confermarne la patogenicità. (Italian)
16 January 2022
0 references
ΚΎΡΙΟΙ ΣΤΌΧΟΙ: 1) Λειτουργικά αναλύστε τις μεταλλάξεις των υποψήφιων γονιδίων GPATCH3, LRP2 και GUCA1C, που είχαν προσδιοριστεί προηγουμένως από την ομάδα μας στη μελέτη εξώμης 26 ασθενών με σοβαρό πρωτοπαθές συγγενές γλαύκωμα. 2) Μελέτη στις προνύμφες zebrafish οι οφθαλμικοί φαινότυποι που προκύπτουν από τη μείωση ή την αύξηση της έκφρασης των ορθολογικών γονιδίων των 3 γονιδίων που αναφέρονται παραπάνω. 3) Αναλύστε την παρουσία μεταλλάξεων υποψήφιων γονιδίων LRP2 και GUCA1C σε 90 ασθενείς με συγγενές γλαύκωμα χωρίς γνωστές μεταλλάξεις. 4) Προσδιορίστε νέα γονίδια που εμπλέκονται στην ασθένεια με επανανάλυση 23 από τα εξώματα που έχουν ήδη ακολουθηθεί, ακολουθώντας μια στρατηγική ανάλυσης τρίο που σχηματίζεται από τον δοκιμαστή και τους υγιείς γονείς του. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΊΑ: Στόχος 1) Οι εντοπισθείσες μεταλλάξεις θα προκύψουν από στοχοθετημένη μεταλλαξιογένεση. Στη συνέχεια, εκφράζονται σε κύτταρα HEK-293T και η σταθερότητα, η υποκυτταρική θέση και η ενεργοποίησή τους αναλύονται με δοκιμές δυτικού κηλιδώματος, ανοσοκυτταροχημείας και λουσιφεράσης, αντίστοιχα. Στόχος 2) Η έκφραση των ορθολογικών γονιδίων των 3 υποψήφιων γονιδίων θα μελετηθεί σε προνύμφες zebrafish, χρησιμοποιώντας φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση και συνομοκρατική μικροσκοπία. Ο οφθαλμικός φαινότυπος θα αναλυθεί επίσης με συνομοκρατική μικροσκοπία μετά την αναστολή της έκφρασης αυτών των ορτολογικών γονιδίων (knockdown με μολφολίνες) και την παροδική υπερέκφρασή τους (μικροένεση mRNA). Στόχος 3) Η ιχνηλάτηση σε 90 ασθενείς των μεταλλάξεων των γονιδίων LRP2 και GUCA1C θα πραγματοποιηθεί με μαζική αλληλουχία (στοχοθετημένη αλληλουχία). Στόχος 4) Για τη μελέτη των 23 εξωμάτων σε τρίο, η αλληλουχία του γονέα exome θα καθορίζεται από την αλληλουχία μάζας. Θα εφαρμοστούν διαφορετικά φίλτρα για τον προσδιορισμό των υποψήφιων παραλλαγών και θα διεξαχθούν λειτουργικές μελέτες για την επιβεβαίωση της παθογένειας τους. (Greek)
17 August 2022
0 references
VIGTIGSTE MÅL: 1) Funktionelt analysere mutationerne af kandidatgener GPATCH3, LRP2 og GUCA1C, tidligere identificeret af vores gruppe i exome-studiet af 26 patienter med svær primær medfødt glaukom. 2) Undersøgelse i zebrafisk larver de okulære fænotyper som følge af at reducere eller øge ekspressionen af ortolog gener af de 3 ovennævnte gener. 3) Analyser tilstedeværelsen af mutationer af kandidat LRP2 og GUCA1C gener hos 90 patienter med medfødt glaukom uden kendte mutationer. 4) Identificer nye gener involveret i sygdommen ved reanalyse af 23 af exomer allerede sekvenseret, efter en trekant analyse strategi dannet af testeren og hans raske forældre. METODE: Mål 1) De identificerede mutationer vil blive genereret af målrettet mutagenese. Derefter udtrykkes de i HEK-293T-celler, og deres stabilitet, subcellulære placering og transaktivering analyseres ved hjælp af henholdsvis Western blot, immunocytochemistry og luciferaseassays. Mål 2) Udtrykket af ortolog gener af de 3 kandidat gener vil blive undersøgt i zebrafisk larver, ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering og konfokal mikroskopi. Den okulære fænotype vil også blive analyseret ved konfokal mikroskopi efter at have hæmmet ekspressionen af disse ortologgener (knockdown med morfoliner) og forbigående overudtrykt dem (mRNA mikroinjektion). Mål 3) Opsporing hos 90 patienter af mutationer af LRP2- og GUCA1C-generne udføres ved massesekventering (målrettet sekventering). Mål 4) Til studiet af de 23 exomer i trekanter vil modereksomsekvensen blive bestemt ved massesekventering. Der vil blive anvendt forskellige filtre til at identificere kandidatvarianter, og der vil blive gennemført funktionelle undersøgelser for at bekræfte deres patogenicitet. (Danish)
17 August 2022
0 references
PÄÄTAVOITTEET: 1) Toiminnallisesti analysoida ehdokasgeenien GPATCH3, LRP2 ja GUCA1C mutaatiot, jotka ryhmämme aiemmin määritti exome-tutkimuksessa 26 potilaalla, joilla oli vaikea synnynnäinen glaukooma. 2) Tutkimuksessa seeprakalan toukkia silmän fenotyypit, jotka johtuvat edellä mainittujen 3 geenin ortologigeenien vähenemisestä tai lisääntymisestä. 3) Analysoidaan ehdokas LRP2- ja GUCA1C-geenien mutaatioita 90 potilaalla, joilla on synnynnäinen glaukooma ilman tunnettuja mutaatioita. 4) Tunnista uusia taudin mukana olevia geenejä analysoimalla uudelleen 23 eksoomia, jotka on jo sekvensoitu, seuraamalla testaajan ja hänen terveiden vanhempiensa muodostamaa kolmiosaista analyysistrategiaa. MENETELMÄT: Tavoite 1) Tunnetut mutaatiot syntyvät kohdennetun mutageneesin avulla. Tämän jälkeen ne on ilmaistava HEK-293T-soluina, ja niiden stabiilisuus, subsellulaarinen sijainti ja transaktivaatio on analysoitava Länsi-blot-, immunosytokemia- ja lusiferaasimääritysten avulla. Tavoite 2) 3 ehdokasgeenin ortologigeenien ilmentymistä tutkitaan seeprakalan touissa fluoresoivalla in situ -hybridisaatiolla ja konfokaalisella mikroskopialla. Silmän fenotyyppi analysoidaan myös konfokaalisella mikroskopialla sen jälkeen, kun näiden ortologigeenien ilmentyminen on estynyt (knockdown with morfolins) ja ohimenevästi yliilmaisemalla niitä (mRNA-mikroinjektio). Tavoite 3) LRP2- ja GUCA1C-geenien mutaatioiden jäljittäminen 90 potilaalla suoritetaan massasekvensoinnilla (kohdennettu sekvensointi). Tavoite 4) Tutkimuksessa 23 eksomas kolmikko, kanta exome sekvenssi määritetään massa sekvenssin. Ehdolla olevien muunnelmien tunnistamiseksi käytetään erilaisia suodattimia, ja niiden patogeenisuuden vahvistamiseksi tehdään toiminnallisia tutkimuksia. (Finnish)
17 August 2022
0 references
GĦANIJIET EWLENIN: 1) Funzjonalment janalizza l-mutazzjonijiet tal-ġeni kandidati GPATCH3, LRP2 u GUCA1C, identifikati qabel mill-grupp tagħna fl-istudju exome ta '26 pazjent bi glawkoma konġenitali primarja severa. 2) Studju fiż-żebra larva l-fenotipi okulari li jirriżultaw mit-tnaqqis jew iż-żieda tal-espressjoni tal-ġeni ortoloġistiċi tat-3 ġeni msemmija hawn fuq. 3) Analiżi tal-preżenza ta’ mutazzjonijiet ta’ ġeni kandidati LRP2 u GUCA1C f’90 pazjent bi glawkoma konġenitali mingħajr mutazzjonijiet magħrufa. 4) Identifika ġeni ġodda involuti fil-marda mill-analiżi mill-ġdid ta '23 ta’ l-exomas diġà sekwenzjati, wara strateġija analiżi threesome ffurmata mill-tester u l-ġenituri b’saħħithom tiegħu. METODOLOĠIJA: Għan 1) Il-mutazzjonijiet identifikati ser jiġu ġġenerati minn mutaġenesi mmirata. Sussegwentement, għandhom jiġu espressi f’ċelloli HEK-293T u l-istabbiltà, il-post subċellulari u t-transattivazzjoni tagħhom għandhom jiġu analizzati bl-użu ta’ analiżi tal-blot tal-Punent, tal-immunoċitokimika u tal-luċiferażi, rispettivament. Għan 2) L-espressjoni tal-ġeni ortoloġistiċi tat-3 ġeni kandidati se tiġi studjata fiż-żebra larvi, bl-użu ta’ ibridizzazzjoni fluworexxenti in situ u mikroskopija konfokali. Il-fenotip okulari se jiġi analizzat ukoll permezz ta’ mikroskopija konfokali wara li tiġi inibita l-espressjoni ta’ dawn il-ġeni ortoloġistiċi (knockdown b’morfolins) u wara li dawn jiġu espressi żżejjed b’mod temporanju (mikroinjezzjoni mRNA). Għan 3) It-traċċar f’90 pazjent ta’ mutazzjonijiet tal-ġeni LRP2 u GUCA1C se jsir permezz ta’ sekwenzar tal-massa (sekwenzar immirat). Għan 4) Għall-istudju tat-23 eżoma fi threesomes, is-sekwenza exome ġenitur se tkun determinata permezz ta ‘sekwenzar tal-massa. Se jiġu applikati filtri differenti biex jiġu identifikati l-varjanti kandidati u se jitwettqu studji funzjonali biex tiġi kkonfermata l-patoġeniċità tagħhom. (Maltese)
17 August 2022
0 references
GALVENIE MĒRĶI: 1) Funkcionāli analizējiet kandidātgēnu GPATCH3, LRP2 un GUCA1C mutācijas, ko mūsu grupa iepriekš identificēja eksome pētījumā ar 26 pacientiem ar smagu primāru iedzimtu glaukomu. 2) Pētījums ar zebrzivs kāpuriem okulāro fenotipu, kas rodas, samazinot vai palielinot iepriekš minēto 3 gēnu ortologu gēnu ekspresiju. 3) Analizējiet kandidāta LRP2 un GUCA1C gēnu mutāciju klātbūtni 90 pacientiem ar iedzimtu glaukomu bez zināmām mutācijām. 4) Noteikt jaunus gēnus, kas iesaistīti slimībā, atkārtoti analizējot 23 jau sekvencētos eksomas, ievērojot trīs analīzes stratēģiju, ko veido testeris un viņa veselie vecāki. METODIKA: Mērķis 1) identificētās mutācijas radīs mērķtiecīga mutaģenēze. Pēc tam tos izsaka HEK-293T šūnās, un to stabilitāti, apakššūnu atrašanās vietu un transaktivāciju analizē, attiecīgi izmantojot rietumu blot, imūncitoķīmiskos un luciferāzes testus. Mērķis 2) 3 kandidātgēnu ortologu gēnu ekspresija tiks pētīta zebrzivs kāpuros, izmantojot fluorescējošo in situ hibridizāciju un konfokālo mikroskopiju. Okulārais fenotips tiks analizēts arī ar konfokālo mikroskopiju pēc šo ortologu gēnu (knockdown ar morfolins) un īslaicīgas to pārmērīgas ekspresijas (mRNS mikroinjekcijas) nomākšanas. Mērķis 3) 90 pacientiem LRP2 un GUCA1C gēnu mutāciju izsekošana tiks veikta ar masveida sekvencēšanu (mērķtiecīga sekvencēšana). Mērķis 4) Pētot 23 eksomas trijās daļās, vecāku exome secību noteiks ar masas sekvencēšanu. Tiks izmantoti dažādi filtri, lai identificētu kandidātus, un tiks veikti funkcionāli pētījumi, lai apstiprinātu to patogenitāti. (Latvian)
17 August 2022
0 references
HLAVNÉ CIELE: 1) Funkčne analyzovať mutácie kandidátskych génov GPATCH3, LRP2 a GUCA1C, predtým identifikované našou skupinou v exome štúdie 26 pacientov so závažným primárnym vrodeným glaukómom. 2) Štúdia na larvach pruhovaných očných fenotypov vyplývajúca z redukcie alebo zvýšenia expresie ortológových génov 3 vyššie uvedených génov. 3) Analyzujte prítomnosť mutácií kandidátskych génov LRP2 a GUCA1C u 90 pacientov s vrodeným glaukómom bez známych mutácií. 4) Identifikujte nové gény zapojené do ochorenia reanalýzou 23 exomas už sekvenovaných, po trojnásobnej analytickej stratégii tvorenej testerom a jeho zdravými rodičmi. METODIKA: Cieľ 1) Určené mutácie budú generované cielenou mutagenézou. Následne sa vyjadria v bunkách HEK-293T a ich stabilita, subcelulárna poloha a transaktivácia sa analyzujú pomocou testov západnej blot, imunocytochémie a luciferázy. Cieľ 2) Expresia ortológových génov 3 kandidátskych génov sa bude študovať na larvách zebrafish s použitím fluorescenčnej hybridizácie in situ a konfokálnej mikroskopie. Očný fenotyp sa bude analyzovať aj konfokálnou mikroskopiou po inhibícii expresie týchto ortológových génov (knockdown s morfolínmi) a prechodne preexpresii (mikroinjekcia mRNA). Cieľ 3) Sledovanie mutácií génov LRP2 a GUCA1C u 90 pacientov sa vykoná hromadným sekvenovaním (cielené sekvenovanie). Cieľ 4) Pre štúdium 23 exomas v trojkach, rodičov exome sekvencia bude určená hromadným sekvenovaním. Na identifikáciu navrhovaných variantov sa použijú rôzne filtre a vykonajú sa funkčné štúdie na potvrdenie ich patogenity. (Slovak)
17 August 2022
0 references
PRÍOMHCHUSPÓIRÍ: 1) Anailís a dhéanamh go feidhmiúil ar shócháin na géinte iarrthóra GPATCH3, LRP2 agus GUCA1C, a d’aithin ár ngrúpa roimhe seo sa staidéar exome de 26 othar a bhfuil glaucoma ó bhroinn mhór bunscoile. 2) Déan staidéar i larbhaí zebrafish na feinitíopaí ocular a eascraíonn as léiriú géinte orthologist de na 3 ghéinte a luaitear thuas a laghdú nó a mhéadú. 3) Déan anailís ar shócháin na n-iarrthóirí LRP2 agus GUCA1C géinte i 90 othar a bhfuil glaucoma ó bhroinn gan sócháin ar a dtugtar. 4) Aithnigh géinte nua a bhfuil baint acu leis an ngalar trí athanailís a dhéanamh ar 23 de na exomas atá seicheamhaithe cheana féin, tar éis straitéis anailíse trisome a chruthaigh an tástálaí agus a thuismitheoirí sláintiúla. MODHEOLAÍOCHT: Cuspóir 1) Ginfear na sócháin a shainaithneofar trí shó-ghineacha spriocdhírithe. Ina dhiaidh sin, cuirfear in iúl iad i gcealla HEK-293T agus déanfar anailís ar a gcobhsaíocht, ar a suíomh focheallach agus ar a n-aistriú trí úsáid a bhaint as measúnachtaí blota thiar, imdhíonchitriceimice agus luciferase, faoi seach. Cuspóir 2) Déanfar léiriú géinte orthologist na 3 géinte iarrthóra a staidéar i larbhaí zebrafish, ag baint úsáide as flúirseach in hybridization situ agus micreascópacht confocal. Déanfar anailís ar an bhfeinitíopa ocúil freisin trí mhicreascópacht confocal tar éis cosc a chur ar léiriú na ngéinte túeolaí seo (knockdown le morfóiliní) agus iad a ró-léiriú go díomuan (micri-instealladh mRNA). Cuspóir 3) Déanfar rianú i 90 othar ar shócháin na ngéinte LRP2 agus GUCA1C trí sheicheamhú maise (seicheamhú spriocdhírithe). Cuspóir 4) Chun staidéar a dhéanamh ar na 23 exomas i dtrí chuid, cinnfear an seicheamh exome tuismitheoir trí sheicheamhú maise. Cuirfear scagairí éagsúla i bhfeidhm chun na hathraithigh iarrthóra a shainaithint agus déanfar staidéir fheidhmiúla chun a bpataigineacht a dheimhniú. (Irish)
17 August 2022
0 references
HLAVNÍ CÍLE: 1) Funkčně analyzovat mutace kandidátských genů GPATCH3, LRP2 a GUCA1C, dříve identifikovaných naší skupinou ve studii exomu 26 pacientů s těžkým primárním vrozeným glaukomem. 2) Studie na larvy zebrafish oční fenotypy vyplývající ze snížení nebo zvýšení exprese ortologových genů 3 výše uvedených genů. 3) Analyzujte přítomnost mutací kandidátských genů LRP2 a GUCA1C u 90 pacientů s vrozeným glaukomem bez známých mutací. 4) Identifikovat nové geny zapojené do onemocnění reanalýzou 23 exomů již sekvenovaných, po trojici analytické strategie vytvořené testerem a jeho zdravými rodiči. METODIKA: Cíl 1) Určené mutace budou generovány cílenou mutagenezí. Následně se vyjádří v buňkách HEK-293T a jejich stabilita, subcelulární poloha a transaktivace se analyzují pomocí západních testů, imunocytochemie a luciferázy. Cíl 2) Exprese ortologových genů 3 kandidátských genů bude studována u larvy zebrafish, pomocí fluorescenční hybridizace in situ a konfokální mikroskopie. Oční fenotyp bude analyzován také konfokální mikroskopií po inhibování exprese těchto ortologových genů (knockdown s morfoliny) a přechodně jejich převyjádření (mikroinjekce MRNA). Cíl 3) Vysledování mutací genů LRP2 a GUCA1C u 90 pacientů se provádí hmotnostním sekvenováním (cílená sekvenace). Cíl 4) Pro studium 23 exomů v trojici bude rodičovská exome sekvence určena hmotnostním sekvenováním. K identifikaci možných variant se použijí různé filtry a budou provedeny funkční studie k potvrzení jejich patogenity. (Czech)
17 August 2022
0 references
PRINCIPAIS OBJETIVOS: 1) Analisar funcionalmente as mutações dos genes candidatos GPATCH3, LRP2 e GUCA1C, previamente identificados pelo nosso grupo no estudo do exoma de 26 doentes com glaucoma congénito primário grave. 2) Estudar em larvas de peixe-zebra os fenótipos oculares resultantes da redução ou aumento da expressão de genes ortólogos dos 3 genes mencionados acima. 3) Analisar a presença de mutações dos genes candidatos LRP2 e GUCA1C em 90 doentes com glaucoma congénito sem mutações conhecidas. 4) Identificar novos genes envolvidos na doença através da reanálise de 23 dos exomas já sequenciados, seguindo uma estratégia de análise de ménage à trois formada pelo testador e seus pais saudáveis. METODOLOGIA: Objectivo 1) As mutações identificadas serão geradas por mutagénese dirigida. Subsequentemente, devem ser expressos em células HEK-293T e a sua estabilidade, localização subcelular e transativação devem ser analisadas utilizando ensaios Western blot, imunocitoquímica e luciferase, respetivamente. Objectivo 2) A expressão dos genes ortologistas dos 3 genes candidatos será estudada em larvas de peixe-zebra, utilizando hibridação fluorescente in situ e microscopia confocal. O fenótipo ocular também será analisado por microscopia confocal depois de inibir a expressão destes genes ortologistas (bater com morfóis) e sobre-expressá-los transitoriamente (microinjeção de ARNm). Objetivo 3) O rastreio em 90 doentes de mutações dos genes LRP2 e GUCA1C será efetuado por sequenciação em massa (sequenciação direcionada). Objetivo 4) Para o estudo dos 23 exomas em sexo a três, a sequência do exoma parental será determinada pelo sequenciamento em massa. Serão aplicados diferentes filtros para identificar as variantes candidatas e serão realizados estudos funcionais para confirmar a sua patogenicidade. (Portuguese)
17 August 2022
0 references
PEAMISED EESMÄRGID: 1) Funktsionaalselt analüüsida kandidaatgeenide GPATCH3, LRP2 ja GUCA1C mutatsioone, mida meie grupp varem tuvastas eksome-uuringus, milles osales 26 raske primaarse kaasasündinud glaukoomiga patsienti. 2) Uurige vöödilise daanio vastsetel silma fenotüüpe, mis tulenevad eespool nimetatud kolme geeni ortoloogide geenide ekspressiooni vähendamisest või suurendamisest. 3) Analüüsige kandidaat LRP2 ja GUCA1C geenide mutatsioone 90 kaasasündinud glaukoomiga patsiendil ilma teadaolevate mutatsioonideta. 4) Tutvuge haigusega seotud uute geenidega, analüüsides 23i eksoomid, mis on juba järjestatud, järgides testija ja tema tervete vanemate moodustatud kolmesugust analüüsistrateegiat. METOODIKA: Eesmärk 1) Määratud mutatsioonid tekivad suunatud mutageneesi teel. Seejärel väljendatakse neid HEK-293T rakkudes ning nende stabiilsuse, rakualuse asukoha ja transaktivatsiooni analüüsimisel kasutatakse vastavalt lääneblot-, immunotsütokeemia- ja lutsiferaasianalüüse. Eesmärk 2) 3 kandidaatgeeni ortoloogide geenide ekspressiooni uuritakse sebrakala vastsetes, kasutades fluorestseeruvat in situ hübridisatsiooni ja konfokaalset mikroskoopiat. Silma fenotüüpi analüüsitakse ka konfokaalse mikroskoopia abil pärast nende ortoloogide geenide ekspressiooni pärssimist (knockdown koos morfiinidega) ja nende ajutist üleekspressiooni (mRNA mikrosüst). Eesmärk 3) LRP2 ja GUCA1C geenide mutatsioonide jälgimine 90 patsiendil toimub massijärjestuse abil (sihtjärjestus). Eesmärk 4) Uurimiseks 23 eksoomi kolmekesi, vanem eksome jada määratakse mass sekveneerimine. Kandidaatvariantide kindlakstegemiseks kasutatakse erinevaid filtreid ja nende patogeensuse kinnitamiseks viiakse läbi funktsionaalsed uuringud. (Estonian)
17 August 2022
0 references
FŐ CÉLKITŰZÉSEK: 1) Funkcionálisan elemezzük a GPATCH3, LRP2 és GUCA1C jelölt gének mutációit, amelyeket korábban csoportunk azonosított a 26 súlyos primer veleszületett glaukómában szenvedő beteg exome-vizsgálatában. 2) A zebradániás lárvák vizsgálata a fent említett 3 gének ortológus génjei expressziójának csökkentéséből vagy növeléséből eredő szemfenotípusokon. 3) elemezze az LRP2 és GUCA1C jelölt gén mutációinak jelenlétét 90, veleszületett glaukómában szenvedő betegnél, ismert mutációk nélkül. 4) Határozza meg a betegségben részt vevő új géneket a már szekvenált 23 exomák újraelemzésével, a tesztelő és egészséges szülei által kialakított hármas elemzési stratégiát követve. MÓDSZERTAN: Célkitűzés: Az azonosított mutációkat célzott mutagenezis idézi elő. Ezt követően ezeket HEK-293T sejtekben kell kifejezni, és stabilitásukat, szubcelluláris elhelyezkedésüket és transzaktivációjukat a nyugati blot, immunocytochemistry és luciferáz vizsgálatok segítségével kell elemezni. Célkitűzés 2) A 3 jelölt gének ortológus génjeinek expresszióját zebradán lárvákban tanulmányozzák fluoreszkáló in situ hibridizációval és konocalis mikroszkópiával. A szemfenotípust ezen ortológus gének (morfolinokkal való knockdown) expressziójának gátlása és átmeneti túlkifejezése (mRNS mikroinjekció) után konocalis mikroszkópiával is elemezni fogják. Célkitűzés: 90 betegnél az LRP2 és a GUCA1C gén mutációinak nyomon követése tömegszekvenálással (célzott szekvenálás) történik. Célkitűzés) A 23 exomák hármasban történő tanulmányozásához a szülő exome szekvenciáját tömegszekvenálással határozzák meg. Különböző szűrőket alkalmaznak a jelölt változatok azonosítására, és funkcionális vizsgálatokat végeznek patogenitásuk megerősítésére. (Hungarian)
17 August 2022
0 references
ОСНОВНИ ЦЕЛИ: 1) Функционално анализирайте мутациите на кандидат-гените GPATCH3, LRP2 и GUCA1C, предварително идентифицирани от нашата група в екзомното проучване при 26 пациенти с тежка първична вродена глаукома. 2) Проучване в ларвите на зеброфини на очните фенотипове, получени от намаляване или увеличаване на експресията на ортологичните гени на трите гени, споменати по-горе. 3) Анализ на наличието на мутации на кандидат LRP2 и GUCA1C гени при 90 пациенти с вродена глаукома без известни мутации. 4) Идентифициране на нови гени, участващи в заболяването чрез повторен анализ на 23 от екзомите вече секвенирани, следвайки стратегия за анализ на тройка, образувана от тестера и здравите му родители. МЕТОДОЛОГИЯ: Цел 1) Идентифицираните мутации ще бъдат генерирани от целенасочена мутагенеза. Впоследствие те се изразяват в клетки HEK-293T и тяхната стабилност, подклетъчно местоположение и трансактивация се анализират, като се използват съответно западно-блот, имуноцитохимия и луцифераза. Цел 2) Изразяването на ортоложки гени на трите кандидат-гена ще бъде проучено в ларвите на зеброфините, като се използва флуоресцентна in situ хибридизация и конфокална микроскопия. Очният фенотип също ще бъде анализиран чрез конфокална микроскопия след инхибиране на експресията на тези ортологични гени (почукване с морфолини) и преходно свръхекспресиране (мРНК микроинжектиране). Цел 3) Проследяването при 90 пациенти на мутации на гените LRP2 и GUCA1C ще се извършва чрез масово секвениране (целево секвениране). Цел 4) За изучаването на 23 екзоми в тройки, родителската екзома ще бъде определена чрез секвениране на масата. Ще се прилагат различни филтри за идентифициране на кандидат-вариантите и ще бъдат проведени функционални изследвания, за да се потвърди тяхната патогенност. (Bulgarian)
17 August 2022
0 references
PAGRINDINIAI TIKSLAI: 1) Funkciškai analizuojame potencialių genų GPATCH3, LRP2 ir GUCA1C mutacijas, kurias anksčiau nustatė mūsų grupė exome tyrime, kuriame dalyvavo 26 pacientai, sergantys sunkia pirmine įgimta glaukoma. 2) zebrinės danties lervų tyrimas su akių fenotipais, gautais mažinant arba didinant pirmiau minėtų 3 genų ortologinių genų ekspresiją. 3) 90 pacientų, sergančių įgimta glaukoma be žinomų mutacijų, analizuokite potencialių LRP2 ir GUCA1C genų mutacijų buvimą. 4) Nustatykite naujus genus, susijusius su liga, iš naujo analizuodami 23 egzomus, jau iš eilės, vadovaudamiesi trimis analizės strategija, kurią sudaro testeris ir jo sveiki tėvai. METODIKA: 1 tikslas. Nustatytos mutacijos atsiranda dėl tikslinės mutagenezės. Vėliau jie išreiškiami HEK-293T ląstelėmis, o jų stabilumas, subląstelinė padėtis ir transaktyvacija analizuojami atitinkamai atliekant vakarietiško bloto, imunocitochemijos ir liuciferazės tyrimus. 2 tikslas. 3 potencialių genų ortologinių genų išraiška bus tiriama zebradinės danties lervose, naudojant fluorescencinę in situ hibridizaciją ir konfokalinę mikroskopiją. Akių fenotipas taip pat bus analizuojamas konfokaliniu mikroskopu, slopinus šių ortologų genų ekspresiją (knockdown su morfolinais) ir laikinai juos per daug išraišką (mRNR mikroinjekcija). 3 tikslas. 90 pacientų LRP2 ir GUCA1C genų mutacijų atsekimas bus atliekamas masės sekos nustatymu (tikslinė sekos nustatymas). Tikslas 4) 23 egzomų tyrimui trise, pirminė exome seka bus nustatoma masės sekos būdu. Siekiant nustatyti galimus variantus, bus taikomi skirtingi filtrai, o jų patogeniškumui patvirtinti bus atliekami funkciniai tyrimai. (Lithuanian)
17 August 2022
0 references
GLAVNI CILJEVI: 1) Funkcionalno analizirati mutacije kandidata gena GPATCH3, LRP2 i GUCA1C, prethodno identificirane od strane naše skupine u exome ispitivanju 26 bolesnika s teškim primarnim prirođenim glaukomom. 2) Ispitivanje ličinki zebrice očnih fenotipova koji su rezultat smanjenja ili povećanja ekspresije ortologa gena 3 gore spomenutih gena. 3) Analizirati prisutnost mutacija kandidata LRP2 i GUCA1C gena u 90 bolesnika s prirođenim glaukomom bez poznatih mutacija. 4) identificirati nove gene koji su uključeni u bolest reanalizom 23 od exomas već sekvenciranih, nakon trostruke strategije analize formirana od strane ispitivača i njegovih zdravih roditelja. METODOLOGIJA: Cilj 1) Utvrđene mutacije generirat će se ciljanom mutagenezom. Zatim se izražavaju u stanicama HEK-293T, a njihova stabilnost, podstanični položaj i transaktivacija analiziraju se testovima zapadne blot, imunocitokemije i luciferaze. Cilj 2) Izražavanje ortologa gena 3 kandidata gena proučavat će se u ličinkama zebrice, koristeći fluorescentnu in situ hibridizaciju i konfokalnu mikroskopiju. Očni fenotip također će se analizirati konfokalnom mikroskopijom nakon inhibicije ekspresije tih ortologa gena (knockdown s morfolinima) i prolazno pretjeranog ekspresije (mRNK mikroinjekcija). Cilj 3) Traćenje u 90 bolesnika mutacija LRP2 i GUCA1C gena će se provoditi masovnom sekvenciranjem (ciljani sekvenciranje). Cilj 4) Za proučavanje 23 exomas u troje, roditeljski egzome slijed će se odrediti masovnom sekvenciranjem. Primjenjivat će se različiti filtri kako bi se utvrdile varijante kandidata i provest će se funkcionalna istraživanja kako bi se potvrdila njihova patogenost. (Croatian)
17 August 2022
0 references
HUVUDMÅL: 1) Funktionellt analysera mutationerna i kandidatgenerna GPATCH3, LRP2 och GUCA1C, som tidigare identifierats av vår grupp i exome-studien på 26 patienter med svår primärt medfödd glaukom. 2) Studie på sebrafisklarver de okulära fenotyperna som är resultatet av att minska eller öka uttrycket av ortologgener av de 3 gener som nämns ovan. 3) Analysera förekomsten av mutationer av kandidaten LRP2 och GUCA1C gener hos 90 patienter med medfödd glaukom utan kända mutationer. 4) Identifiera nya gener som är inblandade i sjukdomen genom en ny analys av 23 av exomas redan sekvenserade, efter en trekant analys strategi bildas av testaren och hans friska föräldrar. METOD: Mål 1) De mutationer som identifieras kommer att genereras av riktad mutagenes. Därefter ska de uttryckas i HEK-293T-celler och deras stabilitet, subcellulära placering och transaktivering ska analyseras med hjälp av Western blot, immunocytochemistry respektive luciferasanalys. Mål 2) Uttrycket av ortologgener av de 3 kandidatgener kommer att studeras i zebrafisk larver, med hjälp av fluorescerande in situ hybridisering och konfokal mikroskopi. Den okulära fenotypen kommer också att analyseras genom konfokal mikroskopi efter att ha hämmat uttrycket av dessa ortologgener (knockdown med morfoliner) och övergående överuttryckt dem (mRNA mikroinjektion). Mål 3) Spårning hos 90 patienter av mutationer av LRP2- och GUCA1C-generna kommer att utföras genom masssekvensering (riktad sekvensering). Mål 4) För studien av 23 exomas i trekanter, kommer den överordnade exome sekvensen att bestämmas genom masssekvensering. Olika filter kommer att användas för att identifiera de kandidatvarianter och funktionella studier kommer att genomföras för att bekräfta deras patogenicitet. (Swedish)
17 August 2022
0 references
PRINCIPALELE OBIECTIVE: 1) Analiza funcțională a mutațiilor genelor candidate GPATCH3, LRP2 și GUCA1C, identificate anterior de grupul nostru în studiul exome efectuat la 26 pacienți cu glaucom congenital primar sever. 2) Studiul larvelor de pește de zebră a fenotipurilor oculare care rezultă din reducerea sau creșterea expresiei genelor ortologiste ale celor 3 gene menționate mai sus. 3) Analizați prezența mutațiilor genelor LRP2 și GUCA1C candidate la 90 de pacienți cu glaucom congenital fără mutații cunoscute. 4) Identificarea genelor noi implicate în boală prin reanaliza a 23 de exoame deja secvențiate, în urma unei strategii de analiză în trei formate de tester și de părinții săi sănătoși. METODOLOGIE: Obiectivul 1) Mutațiile identificate vor fi generate de mutageneza vizată. Ulterior, acestea sunt exprimate în celule HEK-293T, iar stabilitatea, localizarea subcelulară și transactivarea lor se analizează utilizând teste de bilot vestic, imunocitochimie și, respectiv, luciferază. Obiectivul 2) Expoziția genelor ortologiste ale celor 3 gene candidate va fi studiată în larve de pește-zebră, folosind hibridizarea fluorescentă in situ și microscopia confocală. Fenotipul ocular va fi, de asemenea, analizat prin microscopie confocală după inhibarea expresiei acestor gene ortologiste (decuplarea cu morfoline) și supraexprimarea tranzitorie a acestora (microinjectarea ARNm). Obiectivul 3) Urmărirea la 90 de pacienți a mutațiilor genelor LRP2 și GUCA1C va fi efectuată prin secvențiere în masă (secvenție țintă). Obiectiv 4) Pentru studiul celor 23 de exoame în trei, secvența de exome părinte va fi determinată prin secvențierea masei. Se vor aplica diferite filtre pentru identificarea variantelor candidate și se vor efectua studii funcționale pentru a confirma patogenitatea acestora. (Romanian)
17 August 2022
0 references
GLAVNI CILJI: 1) Funkcionalno analizirajte mutacije kandidatovih genov GPATCH3, LRP2 in GUCA1C, ki jih je naša skupina predhodno opredelila v eksomski študiji pri 26 bolnikih s hudim primarnim prirojenim glavkomom. 2) Študija na ličinkah cebric na očesnih fenotipih, ki izhajajo iz zmanjšanja ali povečanja izražanja genov ortologa iz zgoraj navedenih treh genov. 3) Analizirajte prisotnost mutacij kandidatnih genov LRP2 in GUCA1C pri 90 bolnikih s prirojenim glavkomom brez znanih mutacij. 4) Prepoznajte nove gene, ki so vključeni v bolezen, s ponovno analizo 23 eksomov, ki so že bili zaporedni, po strategiji analize v troje, ki so jo oblikovali tester in njegovi zdravi starši. METODOLOGIJA: Cilj 1) Ugotovljene mutacije bodo nastale s ciljno mutagenezo. Nato se izrazijo v celicah HEK-293T, njihova stabilnost, podcelična lega in transaktivacija pa se analizirajo z uporabo testa zahodnega blota, imunocitokemije in luciferaze. Cilj 2) Izraz genov ortologa 3 kandidatnih genov se bo preučeval pri ličinkah cebric z uporabo fluorescenčne hibridizacije in situ in konfokalne mikroskopije. Očesni fenotip bo analiziran tudi s konfokalno mikroskopijo, potem ko bo zaviral izražanje teh ortolognih genov (mRNA z morfolini) in jih prehodno čezmerno izražal (mikroinjiciranje mRNA). Cilj 3) Sledenje mutacij genov LRP2 in GUCA1C pri 90 bolnikih se bo izvajalo z množičnim zaporedjem (ciljno zaporedje). Cilj 4) Za študijo 23 eksomov v troje bo zaporedje eksomov staršev določeno z masnim sekvenciranjem. Za opredelitev možnih variant bodo uporabljeni različni filtri, izvedene pa bodo tudi funkcionalne študije za potrditev njihove patogenosti. (Slovenian)
17 August 2022
0 references
GŁÓWNE CELE: 1) Funkcjonalna analiza mutacji potencjalnych genów GPATCH3, LRP2 i GUCA1C, uprzednio zidentyfikowanych przez naszą grupę w badaniu exome z udziałem 26 pacjentów z ciężką jaskrę pierwotną wrodzoną. 2) Badanie larw danio pręgowanego fenotypami oka wynikającymi ze zmniejszenia lub zwiększenia ekspresji genów ortologicznych 3 wymienionych powyżej genów. 3) Analiza obecności mutacji kandydackich genów LRP2 i GUCA1C u 90 pacjentów z wrodzoną jaskrę bez znanych mutacji. 4) Zidentyfikuj nowe geny biorące udział w chorobie poprzez ponowną analizę 23 egzomatów już zsekwencjonowanych, zgodnie ze strategią analizy trójkącikowej utworzoną przez testera i jego zdrowych rodziców. METODYKA: Cel 1) Wykryte mutacje będą generowane w wyniku docelowej mutagenezy. Następnie wyraża się je w komórkach HEK-293T, a ich stabilność, położenie podkomórkowe i transaktywację analizuje się, stosując odpowiednio testy zachodnich plam, immunocytochemii i lucyferazy. Cel 2) Ekspresja genów ortologa z 3 kandydackich genów będzie badana w larwach danio pręgowanego, przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i mikroskopii konfokalnej. Fenotyp oka będzie również analizowany za pomocą mikroskopii konfokalnej po zahamowaniu ekspresji tych genów ortologów (połamanie z morfolinami) i przemijając ich nadekspresję (mikrowstrzyknięcie mRNA). Cel 3) Śledzenie u 90 pacjentów mutacji genów LRP2 i GUCA1C będzie przeprowadzane poprzez sekwencjonowanie masowe (ukierunkowane sekwencjonowanie). Cel 4) Do badania 23 exomas w trójkącikach, sekwencja exome rodzica zostanie określona przez sekwencjonowanie masowe. W celu identyfikacji proponowanych wariantów zostaną zastosowane różne filtry, a badania funkcjonalne zostaną przeprowadzone w celu potwierdzenia ich patogeniczności. (Polish)
17 August 2022
0 references
Albacete
0 references
20 December 2023
0 references
Identifiers
PI15_01193
0 references