ELUCIDATION OF THE STRUCTURE OF THE RECOMBINANT PRPSC PRIONS (Q3165564)

LOS PRIONES SON PROTEINAS INFECCIOSAS. SON VERSIONES MAL-PLEGADA DE PRTEINAS ISOSECUENCIALES CON PLEGAMIENTO NORMAL QUE SE PROPAGAN FORZANDO SU CONFORMACION EN SU PRECURSOR. LA PRPSC (PROTEINA PRIONICA, ISOFORMA SCRAPIE), EL PRIMER PRION QUE SE DESCUBRIO, ES EL AGENTE CAUSAL DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS MORTALES QUE AFECTAN A LOS SERES HUMANOS, COMO LA ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB, Y A LOS ANIMALES, COMO LA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME BOVINA (EEB), O ¿ENFERMEDAD DE LAS VACAS LOCAS¿. INVESTIGACIONES LLEVADAS A CABO POR NUESTRO GRUPO Y OTROS HAN DEMOSTRADO QUE LA ARQUITECTURA DE LA PRPSC CONSISTE EN UN SOLENOIDE- DE 4 PISOS, QUE SE APILA PARA FORMAR PROTOFILAMENTOS AMILOIDES. EL CONOCIMIENTO DE ESTAS CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES, HA PERMITIDO COMPRENDER COMO SE PROPAGA LA PRPSC: LAS LAMINAS- DESAPAREADAS DE LOS PISOS SUPERIOR E INFERIOR DEL PROTOFILAMENTO ACTUAN DE MOLDE PARA CUALQUIER MOLECULA DE PRP DESPLEGADA QUE SE ACERQUE, FORZANDOLA A FORMAR LAMINAS- SIMILARES, Y POSTERIORMENTE ENROLLARSE PARA FORMAR PISOS ADICIONALES A MEDIDA QUE APARECEN NUEVAS SUPERFICIES DE LAMINAS- DESAPAREADAS. SIN EMBARGO, HAY MUCHOS ASPECTOS DE LA BIOLOGIA DE LA PRPSC QUE NO PUEDEN EXPLICARSE CON EL GRADO DE CONOCIMIENTO ESTRUCTURAL ACTUAL. EN PARTICULAR, LA EXISTENCIA DE BARRERAS DE TRANSMISION ENTRE ESPECIES, O LA EXISTENCIA DE ¿CEPAS¿ DE PRPSC QUE TENIENDO LA MISMA SECUENCIA, EXHIBEN PROPIEDADES BIOQUIMICAS Y BIOLOGICAS DIFERENTES. EN ESTE CONTEXTO, NUESTRA PROPUESTA BUSCA LA OBTENCION DE MAS INFORMACION SOBRE LA ESTRUCTURA DE LA PRPSC , PARA PODER ASI REFINAR NUESTRO MODELO ESTRUCTURAL ACTUAL. ES LA CONTINUACION DE NUESTRO PROYECTO DEL PLAN NACIONAL BFU2013-48436-C2-1-P. A TRAVES DE ESE PROYECTO, ABRIMOS EL CAMINO PARA USAR PRPSC RECOMBINANTE (RECPRPSC) COMO UN ANALOGO ADECUADO DE LA PRPSC DE CEREBRO EN ESTUDIOS ESTRUCTURALES. PARA ELLO COLABORAMOS CON JOAQUIN CASTILLA (CIC-BIOGUNE, BILBAO) EN EL DESARROLLO DE METODOS PARA PRODUCIR CANTIDADES SIGNIFICATIVAS DE RECPRPSC INFECCIOSA. POSTERIORMENTE, DETERMINAMOS QUE LA RECPRPSC Y LA PRPSC DE CEREBRO COMPARTEN UNA MISMA ARQUITECTURA BASICA Y DESARROLLAMOS METODOS DE RMN EN SOLUCION PARA ESTUDIAR LA RECPRPSC. _x000D_ PROVISTOS DE TODO ESTO, NOS PROPONEMOS: 1) DILUCIDAR SI EL APILAMIENTO DE LAS UNIDADES DE RECPRPSC A LO LARGO DEL PROTOFILAMENTO DE RECPRPSC ES ¿CABEZA-CABEZA¿ O ¿CABEZA-COLA¿; 2: EXPANDIR LA INFORMACION OBTENIDA HASTA LA FECHA MEDIANTE PROTEOLISIS LIMITADA, ACOPLANDO LA TECNICA A UN DESPLEGAMIENTO PARCIAL DE LA RECPRPSC. ESPECIFICAMENTE, BUSCAMOS CONFIRMAR LA IDENTIDAD DE LAS LAMINAS- Y LAZOS QUE HEMOS IDENTIFICADO TENTATIVAMENTE, E IDENTIFICAR MAS, PARTICULARMENTE EN LOS 2 PISOS C-TERMINALES; 3: EXPANDIR LA METODOLOGIA DE RMN EN SOLUCION DESARROLLADA EN BFU2013-48436-C2-1-P UTILIZANDO APROXIMACIONES EXPERIMENTALES DIFERENTES PARA DESPLEGAR PARCIALMENTE LA RECPRPSC, Y ASI PODER CONFIRMAR Y AMPLIAR LOS DATOS OBTENIDOS; 4: INICIAR ESTUDIOS DE RMM DE ESTADO SOLIDO DE LA RECPRPSC; NOS PROPONEMOS EMPEZAR CON EXPERIMENTOS SIMPLES 1D PARA CALCULAR CUANTOS AMINOACIDOS DE CADA TIPO ESTAN LOCALIZADOS EN LAMINAS- Y CUANTOS EN LAZOS; 5: INTEGRAR TODOS LOS DATOS OBTENIDOS EN UN MODELO ESTRUCTURAL CADA VEZ MAS REFINADO DE LA RECPRPSC, QUE INCLUIRA UN ALINEAMIENTO CON ESQUELETOS -SOLENOIDEOS CONOCIDOS. TODO ESTO DEBERIA CONDUCIR A UN MODELO ATOMISTICO DE LA PRPSC QUE ESPERAMOS SE CONVIERTA EN UNA REFERENCIA PARA EL CAMPO. (Spanish)

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PRIONS ARE INFECTIOUS PROTEINS. THEY ARE MISFOLDED VERSIONS OF NORMALLY FOLDED ISOSEQUENTIAL PROTEINS. PRIONS PROPAGATE BY FORCING THEIR CONFORMATION INTO THEIR NORMALLY FOLDED PRECURSORS. PRPSC (PRION PROTEIN, SCRAPIE ISOFORM), THE FIRST PRION TO BE DISCOVERED, IS THE CAUSAL AGENT OF DEADLY NEURODEGENERATIVE DISEASES AFFECTING HUMANS, LIKE CREUTZFELDT-JAKOB DISEASE, AND ANIMALS, LIKE BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY (BSE), ALSO KNOWN AS ¿MAD COW DISEASE¿. RESEARCH FROM OUR AND OTHER GROUPS HAS SHOWN THAT THE ARCHITECTURE OF PRPSC CONFORMS TO A 4-RUNG -SOLENOID, THAT STACKS TO FORM AMYLOID PROTOFILAMENTS. KNOWLEDGE OF THESE STRUCTURAL CHARACTERISTICS, STILL OF A LOW RESOLUTION, ALLOW, NEVERTHELESS, AN UNDERSTANDING OF HOW PRPSC PROPAGATES: THE UNPAIRED -STRANDS IN THE UPPER- AND LOWERMOST RUNGS OF THE PROTOFILAMENT CAN TEMPLATE AN INCOMING UNFOLDED PRP MOLECULE TO FORM SIMILAR -STRANDS, AND THEN COIL TO FORM ADDITIONAL RUNGS AS FRESH UNPAIRED -STRANDS ARE FORMED. HOWEVER, THERE ARE MANY KEY ASPECTS OF PRPSC BIOLOGY THAT MUST BE OBVIOUSLY ENCIPHERED IN ITS STRUCTURE AND THEREFORE CANNOT BE EXPLAINED WITH THE CURRENT LEVEL OF STRUCTURAL RESOLUTION. IN PARTICULAR, THE EXISTENCE OF TRANSMISSION BARRIERS BETWEEN SPECIES OR PRPSC STRAINS, WHICH HAVING THE SAME SEQUENCE, EXHIBIT DIFFERENT BIOCHEMICAL AND BIOLOGICAL PROPERTIES. FURTHERMORE, A MORE DETAILED ELUCIDATION OF THE STRUCTURE OF PRPSC WILL HELP RATIONALLY DESIGN DRUGS FOR THESE CURRENTLY FATAL DISEASES._x000D_ IN THIS CONTEXT, OUR PROPOSAL AIMS AT OBTAINING FURTHER STRUCTURAL INFORMATION ON THE STRUCTURE OF PRPSC PRIONS, SO AS TO REFINE THE CURRENT STRUCTURAL MODEL. IT IS A CONTINUATION OF OUR CURRENT NATIONAL GRANT, BFU2013-48436-C2-1-P. THROUGH THIS PROJECT, WE PAVED THE WAY TO USE RECOMBINANT PRPSC (RECPRPSC) AS AN APPROPRIATE SURROGATE OF BRAIN-DERIVED PRPSC FOR STRUCTURAL STUDIES. FOR THIS, WE COLLABORATED WITH JOAQUIN CASTILLA (CIC-BIOGUNE, BILBAO) TO DEVELOP METHODS TO PRODUCE SIGNIFICANT AMOUNTS OF FULLY INFECTIOUS RECPRPSC. THEN, USING LIMITED PROTEOLYSIS AND ELECTRON MICROSCOPY STUDIES, WE OBTAINED STRONG EVIDENCE INDICATING THAT BRAIN AND RECPRPSC SHARE A COMMON BASIC ARCHITECTURE. FINALLY, WE DEVELOPED SOLUTION NMR METHODS TO STUDY RECPRPSC. _x000D_ ARMED WITH ALL THIS, WE PROPOSE NOW: 1) TO ELUCIDATE WHETHER THE STACKING OF RECPRPSC SUBUNIT ALONG THE RECPRPSC PROTOFILAMENT IS HEAD-TO-HEAD OR HEAD-TO-TAIL; 2: TO EXPAND THE LIMITED PROTEOLYSIS DATA OBTAINED THUS FAR, COUPLING IT TO PARTIAL UNFOLDING. WE SPECIFICALLY SEEK TO CONFIRM THE IDENTITY OF -STRANDS AND LOOPS THAT WE HAVE ALREADY TENTATIVELY IDENTIFIED, AND TO IDENTIFY ADDITIONAL -STRANDS AND LOOPS IN THE 2 C-TERMINAL RUNGS; 3: TO EXPAND THE SOLUTION NMR METHODOLOGY DEVELOPED THROUGH BFU2013-48436-C2-1-P USING ALTERNATIVE APPROACHES TO RECPRPSC PARTIAL UNFOLDING, SO AS TO CONFIRM AND EXTEND THE DATA THAT WE HAVE OBTAINED THUS FAR; 4: TO INITIATE SOLID STATE NMR APPROACHES TO STUDY RECPRPSC DIRECTLY. IN PARTICULAR, WE PROPOSE TO BEGIN WITH A SIMPLE 1D SOLID NMR APPROACH TO ASSESS HOW MANY AMINO ACIDS OF EACH TYPE ARE LOCATED IN -STRANDS VS. COILS; 5: TO INTEGRATE ALL STRUCTURAL RESTRAINTS OBTAINED THROUGH THE PRECEDING AIMS INTO AN EVER MORE REFINED STRUCTURAL MODEL OF RECPRPSC, INCLUDING THREADING AND MODELING USING KNOWN -SOLENOID SCAFFOLDS.ALL THIS SHOULD LEAD TO AN IMPROVED, ATOMISTIC MODEL OF PRPSC WHICH SHOULD BECOME A REFERENCE IN THE FIELD. (English)

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LES PRIONS SONT DES PROTÉINES INFECTIEUSES. CE SONT DES VERSIONS MAL DÉPLOYÉES DE PRTEINS ISOSEQUENCIAUX AVEC UN PLIAGE NORMAL QUI SE PROPAGE EN FORÇANT LEUR FORMATION DANS LEUR PRÉCURSEUR. PRPSC (PROTÉINES PRIONICA, TREMBLANTE ISOFORMA), LE PREMIER PRION À ÊTRE DÉCOUVERT, EST-IL L’AGENT CAUSAL DE MALADIES NEURODÉGÉNÉRATIVES MORTELLES AFFECTANT L’HOMME, COMME LA MALADIE DE CREUTZFELDT-JAKOB, ET LES ANIMAUX, COMME L’ENCÉPHALOPATHIE SPONGIFORME BOVINE (ESB) OU LA MALADIE DE LA VACHE FOLLE? DES RECHERCHES MENÉES PAR NOTRE GROUPE ET D’AUTRES ONT MONTRÉ QUE L’ARCHITECTURE DE LA PRPSC SE COMPOSE D’UN SOLÉNOÏDE DE 4 ÉTAGES, QUI EST EMPILÉ POUR FORMER DES PROTOFILAMENTS AMYLOÏDES. LA CONNAISSANCE DE CES CARACTÉRISTIQUES STRUCTURELLES NOUS A PERMIS DE COMPRENDRE COMMENT PRPSC SE PROPAGE: LES STRATIFIÉS NON APPARIÉS DES ÉTAGES SUPÉRIEURS ET INFÉRIEURS DE L’ACTE DE PROTOFILAMENT DE MOULE POUR TOUT PRP MOLECULATE DÉPLOYÉ QUI APPROCHE, LE FORÇANT À FORMER DES LAMINAS, PUIS ENROULÉS POUR FORMER DES PLANCHERS SUPPLÉMENTAIRES À MESURE QUE DE NOUVELLES SURFACES NON APPARIÉS DE LAMINAS- APPARAISSENT. CEPENDANT, IL EXISTE DE NOMBREUX ASPECTS DE LA BIOLOGIE DE LA PRPSC QUI NE PEUVENT ÊTRE EXPLIQUÉS AVEC LE DEGRÉ ACTUEL DE CONNAISSANCES STRUCTURELLES. EN PARTICULIER, L’EXISTENCE DE BARRIÈRES DE TRANSMISSION ENTRE LES ESPÈCES, OU L’EXISTENCE DE SOUCHES DE PRPSC AYANT LA MÊME SÉQUENCE, PRÉSENTENT DES PROPRIÉTÉS BIOCHIMIQUES ET BIOLOGIQUES DIFFÉRENTES. DANS CE CONTEXTE, NOTRE PROPOSITION VISE À OBTENIR PLUS D’INFORMATIONS SUR LA STRUCTURE DE LA PRPSC, AFIN D’AFFINER NOTRE MODÈLE STRUCTUREL ACTUEL. C’EST LA POURSUITE DE NOTRE PROJET DU PLAN NATIONAL BFU2013-48436-C2-1-P. À TRAVERS CE PROJET, NOUS OUVRONS LA VOIE À L’UTILISATION DE PRPSC RECOMBINANT (RECPRPSC) COMME UN ANALOGUE APPROPRIÉ DE LA PRPSC CÉRÉBRALE DANS LES ÉTUDES STRUCTURELLES. À CETTE FIN, NOUS AVONS COLLABORÉ AVEC JOAQUIN CASTILLA (CIC-BIOGUNE, BILBAO) À LA MISE AU POINT DE MÉTHODES POUR PRODUIRE DES QUANTITÉS SIGNIFICATIVES DE RECPRPSC INFECTIEUX. PAR LA SUITE, NOUS AVONS DÉTERMINÉ QUE RECPRPSC ET LE CERVEAU PRPSC PARTAGENT LA MÊME ARCHITECTURE DE BASE ET DÉVELOPPÉ DES MÉTHODES D’IRM EN SOLUTION POUR ÉTUDIER RECPRPSC. _x000D_ fourni de TOUS CE CE, NOUS PROPONEZ-NOUS: 1) DÉTERMINER SI L’EMPILEMENT DES UNITÉS RECPRPSC LE LONG DU PROTOFILAMENT DE RECPRPSC EST LA TÊTE-TÊTE OU LA QUEUE; 2: ÉLARGIR L’INFORMATION OBTENUE À CE JOUR GRÂCE À UNE PROTÉOLYSE LIMITÉE, COUPLÉ LA TECHNIQUE À UN DÉPLOIEMENT PARTIEL DE RECPRPSC. PLUS PRÉCISÉMENT, NOUS CHERCHONS À CONFIRMER L’IDENTITÉ DES LAMINAS- ET LES LIENS QUE NOUS AVONS PROVISOIREMENT IDENTIFIÉS, ET À IDENTIFIER DAVANTAGE, EN PARTICULIER SUR LES 2 ÉTAGES C-TERMINAL; 3: DÉVELOPPER LA MÉTHODOLOGIE DE RMN EN SOLUTION DÉVELOPPÉE DANS LE BFU2013-48436-C2-1-P EN UTILISANT DIFFÉRENTES APPROCHES EXPÉRIMENTALES POUR DÉPLOYER PARTIELLEMENT RECPRPSC, CONFIRMANT ET ÉLARGISSANT AINSI LES DONNÉES OBTENUES; 4: ENTREPRENDRE DES ÉTUDES RECPRPRPSC SUR LE RMR SOLIDE À L’ÉTAT SOLIDE; NOUS AVONS L’INTENTION DE COMMENCER PAR DES EXPÉRIENCES 1D SIMPLES POUR CALCULER COMBIEN D’ACIDES AMINÉS DE CHAQUE TYPE SONT SITUÉS DANS LAMINAS- ET COMBIEN DANS LES LIENS; 5: INTÉGRER TOUTES LES DONNÉES OBTENUES DANS UN MODÈLE STRUCTUREL DE PLUS EN PLUS RAFFINÉ DE RECPRPSC, QUI INCLURA L’ALIGNEMENT AVEC LES SQUELETTES CONNUS — SOLENOIDES. TOUT CELA DEVRAIT CONDUIRE À UN MODÈLE ATOMISTE DE LA PRPSC QUI, NOUS L’ESPÉRONS, DEVIENDRA UNE RÉFÉRENCE POUR LE DOMAINE. (French)

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4 December 2021

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PRIONEN SIND INFEKTIÖSE PROTEINE. SIE SIND SCHLECHT EINGESETZTE VERSIONEN VON ISOSEQUENCIAL PRTEINS MIT NORMALER FALTUNG, DIE SICH AUSBREITEN, INDEM SIE IHRE BILDUNG IN IHREN VORLÄUFER ZWINGEN. PRPSC (PROTEIN PRIONICA, ISOFORMA SCRAPIE), DAS ERSTE ZU ENTDECKENDE PRION, IST DER URSÄCHLICHE ERREGER TÖDLICHER NEURODEGENERATIVER ERKRANKUNGEN, DIE DEN MENSCHEN BETREFFEN, WIE DER CREUTZFELDT-JAKOB-KRANKHEIT UND VON TIEREN, WIE Z. B. BOVINE SPONGIFORME ENZEPHALOPATHIE (BSE) ODER VERRÜCKTE KUHKRANKHEIT? FORSCHUNGEN UNSERER GRUPPE UND ANDERER HABEN GEZEIGT, DASS DIE ARCHITEKTUR DES PRPSC AUS EINEM 4-STÖCKIGEN SOLENOID BESTEHT, DAS ZU AMYLOIDPROTOFILAMENTEN GESTAPELT WIRD. DIE KENNTNIS DIESER STRUKTURELLEN MERKMALE HAT UNS ERLAUBT ZU VERSTEHEN, WIE SICH PRPSC VERBREITET: DIE UNVERPAARTEN LAMINATE DER OBEREN UND UNTEREN ETAGE DES PROTOFILAMENT-SCHIMMELGESETZES FÜR JEDES EINGESETZTE PRP MOLECULATE, DAS SICH NÄHERT, ZWINGT ES, LAMINASARTIG ZU BILDEN, UND ANSCHLIESSEND ZU ZUSÄTZLICHEN BÖDEN GEWICKELT, WIE NEUE UNVERPAARTE LAMINAS- OBERFLÄCHEN ERSCHEINEN. ES GIBT JEDOCH VIELE ASPEKTE DER PRPSC-BIOLOGIE, DIE MIT DEM DERZEITIGEN GRAD AN STRUKTURELLEM WISSEN NICHT ERKLÄRT WERDEN KÖNNEN. INSBESONDERE DAS VORHANDENSEIN VON ÜBERTRAGUNGSBARRIEREN ZWISCHEN ARTEN ODER DAS VORHANDENSEIN VON PRPSC-STÄMMEN, DIE DIE GLEICHE ABFOLGE HABEN, WEISEN UNTERSCHIEDLICHE BIOCHEMISCHE UND BIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN AUF. IN DIESEM ZUSAMMENHANG ZIELT UNSER VORSCHLAG DARAUF AB, MEHR INFORMATIONEN ÜBER DIE STRUKTUR DES PRPSC ZU ERHALTEN, UM UNSER DERZEITIGES STRUKTURMODELL ZU VERFEINERN. ES IST DIE FORTSETZUNG UNSERES PROJEKTS DES NATIONALEN PLANS BFU2013-48436-C2-1-P. DURCH DIESES PROJEKT, ÖFFNEN WIR DEN WEG, REKOMBINANT PRPSC (RECPRPSC) ALS GEEIGNETE ANALOGIE DES GEHIRNS PRPSC IN STRUKTURSTUDIEN ZU VERWENDEN. ZU DIESEM ZWECK HABEN WIR MIT JOAQUIN CASTILLA (CIC-BIOGUNE, BILBAO) BEI DER ENTWICKLUNG VON METHODEN ZUR HERSTELLUNG SIGNIFIKANTER MENGEN AN INFEKTIÖSEM RECPRPSC ZUSAMMENGEARBEITET. ANSCHLIESSEND HABEN WIR FESTGESTELLT, DASS RECPRPSC UND GEHIRN PRPSC DIE GLEICHE GRUNDARCHITEKTUR HABEN UND MRT-METHODEN IN DER LÖSUNG ZUR STUDIE VON RECPRPSC ENTWICKELT HABEN. _x000D_ zur Verfügung gestellt von ALLES, WIR PROPONE US: 1) UM FESTZUSTELLEN, OB DAS STAPELN VON RECPRPSC-EINHEITEN ENTLANG DES PROTOFILAMENTS VON RECPRPSC KOPF ODER KOPFSCHWANZ IST; 2: ERWEITERN SIE DIE BISHER ERHALTENEN INFORMATIONEN DURCH BEGRENZTE PROTEOLYSE, GEKOPPELT DIE TECHNIK ZU EINEM TEILWEISEN EINSATZ VON RECPRPSC. INSBESONDERE VERSUCHEN WIR, DIE IDENTITÄT DER LAMINAS- UND BINDUNGEN, DIE WIR VORLÄUFIG IDENTIFIZIERT HABEN, ZU BESTÄTIGEN UND INSBESONDERE AUF DEN 2 C-TERMINALBÖDEN MEHR ZU IDENTIFIZIEREN; 3: DIE NMR-METHODIK IN DER IN BFU2013-48436-C2-1-P ENTWICKELTEN LÖSUNG UNTER VERWENDUNG VERSCHIEDENER EXPERIMENTELLER ANSÄTZE ZUR TEILWEISEN BEREITSTELLUNG VON RECPRPSC ZU ERWEITERN UND SO DIE GEWONNENEN DATEN ZU BESTÄTIGEN UND ZU ERWEITERN; 4: INITIIEREN SIE RECPRPSC-MASSIV-STATE-MMR-STUDIEN; WIR BEABSICHTIGEN, MIT EINFACHEN 1D-EXPERIMENTEN ZU BEGINNEN, UM ZU BERECHNEN, WIE VIELE AMINOSÄUREN JEDES TYPS IN LAMINAS- UND WIE VIELE VERBINDUNGEN LIEGEN; 5: INTEGRIEREN SIE ALLE GEWONNENEN DATEN IN EIN ZUNEHMEND VERFEINERTES STRUKTURELLES MODELL VON RECPRPSC, DAS DIE AUSRICHTUNG AUF BEKANNTE SKELETTS – SOLENOIDES – EINSCHLIESST. ALL DIES SOLLTE ZU EINEM ATOMISTISCHEN MODELL DES PRPSC FÜHREN, DAS WIR HOFFEN, EINE REFERENZ FÜR DAS FELD ZU WERDEN. (German)

point in time

9 December 2021

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Santiago de Compostela

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BFU2017-86692-P

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