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Los organismos están formados por millones de células que comparten el mismo contenido genético pero que, sin embargo, tienen características distintivas y realizan funciones muy diversas. Esto sucede porque cada tipo de célula expresa una colección específica de genes que la caracteriza y la distingue de otros tipos celulares. Tal escenario es posible gracias a los mecanismos epigenéticos que regulan de manera minuciosa la expresión génica. Como consecuencia, las poblaciones celulares también presentan identidades epigenéticas diferenciadas entre ellas. En este contexto, el estudio de estos perfiles epigenéticos resulta esencial para comprender la regulación de genes en poblaciones celulares normales y aberrantes, dado que la desregulación de estos mecanismos se encuentra fuertemente asociada a múltiples enfermedades como el cáncer, trastornos neurológicos y patologías inmunológicas._x000D_ Gracias al creciente desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva, la posibilidad de realizar estudios genómicos a nivel de células aisladas (de una sola célula o ¿single-cell¿) se ha convertido en una realidad en los últimos años. La caracterización del epigenoma a nivel ¿single cell¿ nos proporciona información adicional, como el estado de diferenciación de cada célula, su origen y los linajes clonales que se derivan de ella._x000D_ La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es la técnica elegida por la mayoría de los laboratorios para estudiar las interacciones ADN-proteína. Sin embargo, actualmente no existe ninguna tecnología en el mercado que resulte eficiente, fiable y fácil de implementar para la realización de experimentos de ChIP-Seq a nivel ¿single cell¿. Hasta ahora, solamente un estudio, publicado en 2015, ha propuesto un método para la realización de dicho ensayo; posteriormente, no se ha reportado ningún otro trabajo usando la misma tecnología ni se ha desarrollado ninguna aplicación comercial, lo que indica que la implementación de la técnica no es trivial. En nuestro grupo, hemos desarrollado un método innovador, llamado FLEA-ChIP, para identificar interacciones ADN-proteína a nivel genómico con poco material (hasta 100 células). Esta técnica permite caracterizar, de forma altamente específica y de manera reproducible, el perfil epigenético de diferentes poblaciones o tipos celulares, y está especialmente indicada para trabajos con muestras raras y difíciles de obtener, ya sea de células en cultivo o de tejidos._x000D_ El objetivo principal de este proyecto es implementar la tecnología FLEA-ChIP para el análisis de interacciones ADN-proteína a nivel ¿single cell¿, desarrollando un protocolo nuevo e innovador tanto para células en cultivo como para células provenientes de tejidos desagregados. Para ello, proponemos, primero, adaptar el protocolo FLEA-ChIP a células aisladas y, segundo, incorporar tecnologías ¿droplet-based¿ (también conocidas como sistemas micro-fluidos) para aumentar la eficiencia y permitir la automatización de la técnica. Se investigarán diferentes estrategias para la fragmentación de la cromatina y la ligación de adaptadores y, en última instancia, se evaluarán diferentes sistemas de micro-fluidos para garantizar la optimización de la técnica, así como para facilitar la futura comercialización de la misma._x000D_ Creemos que el single-cell FLEA-ChIP representará una tecnología de vanguardia en el campo epigenético, ya que permitirá analizar con resolución de una sola célula el epigenoma de poblaciones celulares específicas. Este tipo de estudios son cruciales para comprender los mecanismos transcripcionales específicos de poblaciones raras, por ejemplo, células madre tumorales, ya que permitirán rastrear los linajes clonales de estas células para caracterizar en detalle la memoria celular y la regulación génica a lo largo del desarrollo tumoral. En un futuro, esperamos que esta tecnología, junto a otras técnicas ¿single-cell¿, alcancen el sistema sanitario, donde representarán un avance clave para la implementación de la medicina personalizada. Esperamos que el método single-cell FLEA-ChIP se convierta en el protocolo de referencia para la realización de experimentos de single-cell ChIP en la comunidad científica, ocupando la brecha tecnológica que existe hoy en día para esta metodología en el mercado. (Spanish)

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Organisms are formed by millions of cells that share the same genetic content but, nevertheless, present distinctive characteristics and perform very different functions. Namely, each cell type expresses a specific collection of genes that characterizes and distinguishes it from other cell types, due to the epigenetic mechanisms that tightly regulate gene expression. Thus, cell populations have differentiated epigenetic identities, this is, the pattern of epigenetic features that distinguishes them from the other cells. In this context, the study of these epigenetic landscape turns to be essential to understand gene regulation in healthy and disease populations, as deregulation of these regulatory mechanisms is tightly associated to important diseases like cancer, neurological disorders and immunologic pathologies. _x000D_ Thanks to the growing development of next-generation sequencing technologies, the challenge of performing genomic studies at the level of isolated cells (single-cell) has become a reality in the recent years. The characterization of the epigenome at the single-cell level will provide additional information, such as the differentiation status of each cell, its origin and the clonal lineages that derive from it._x000D_ Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is the technique chosen by most laboratories to study the particular epigenomic signature of tissues and cell types. However, no technologies exist up to date to efficiently, reliably and easily allow to perform ChIP-Seq experiments at single cell level. Up to present, just one study has been reported, in 2015, but no other work has been subsequently published nor commercial application launched in the market based on this technology, indicating that its implementation is not trivial. In our group, we have developed an innovative method, called FLEA-ChIP, to identify DNA-protein interactions at genome-wide level in ultra-low-input samples (down to 100 cells). This technique allows to characterize, in a highly specific and reproducible manner, the epigenetic state of different population or cell types, especially from rare and difficult-to-collect samples, either from cultured cells or tissues._x000D_ The main aim of the proposal is to push the limits of the FLEA-ChIP technology and implement it for the analysis of DNA-protein interactions at single-cell level, developing a novel and innovative protocol for both cultured cells and cells from disaggregated tissues. To do so, we propose, first, to adapt the FLEA-ChIP protocol to single-cell and, next, to incorporate it into droplet-based technologies (microfluidic systems), to increase efficiency and to allow for automation of the technique. Different strategies for chromatin fragmentation and adapter ligation and, ultimately, several microfluidics systems will be evaluated to ensure optimization of the technique, as well as to facilitate its future commercialization._x000D_ We envision single-cell FLEA-ChIP to become a cutting-edge technology in the epigenetic field, as it will allow for the analysis of the epigenome of particular cell populations from healthy and diseased tissues at single-cell resolution. Such kind of studies are crucial to understand gene regulatory mechanisms that are specific for rare and heterogeneous populations cells, such as tumor stem cells, as they will allow to track down the clonal linages to further characterize cell memory and transcriptional regulation along tumor progression. Eventually, this technology, altogether with other single-cell approaches, is expected to reach the healthcare system, where it will represent a key advance in personalized medicine implementation. We expect the FLEA-ChIP method to become the reference protocol for single-cell ChIP experiments among the research community, as well as to fill the technological gap existing for this methodology in the market. (English)

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